基于核酸适体的多功能上转换纳米探针的研究

发布时间：2020-10-30 10:07

　　 伴随着生命科学和现代医学技术的快速发展,人类运用分子生物学和各种疾病诊断与治疗方法在探索与实现疾病早期诊疗方面已经取得了很大进展。但据2017年中国国家癌症中心发布的数据结果显示,癌症新发人数仍在持续升高,癌症仍是致使国人死亡的重要因素。传统的癌症治疗手段,如化疗,通常因为化疗药物的非特异性作用,在癌症给药治疗过程中对患者造成严重的副作用,引发各种并发症。常用的癌症诊断技术如X射线扫描或CT扫描等影像学检测方法灵敏度低,存在假阳性信号导致过度诊疗或错过了最佳诊疗时间。因此,建立和发展高灵敏的癌症精准早期诊断技术和高效的靶向精准癌症治疗手段是提高癌症患者生存率的关键,已成为全球生命科学研究和创新研制精准治疗药物的首要任务。自20世纪90年代首次提出核酸适体的概念及研究成果发表以来,经过近30年的研究,它已成为分子生物学、分析化学、生物化学、医学、生物信息学、药学和纳米材料等众多学科领域的研究热点之一。核酸适体是一种备受关注的新型识别分子,被称为“化学家的抗体”,具有高选择性、高特异性、靶标范围广、免疫原性低、生物相容性好、易合成与修饰和易保存等许多优点,已成为一类可以用于癌症精准早期诊断与高效个性化治疗的新型靶向配体。另一方面,纳米材料由于其独特的物理化学性质、尺寸小、比表面积大、负载能力强、生物相容性好和易修饰等优点,在生物成像和治疗领域具有广阔的应用前景。基于以上研究背景,围绕如何将核酸适体功能化的纳米材料和病毒载体应用到癌症的早期诊断和治疗中,本论文开发了一系列新型多功能纳米诊疗体系并用于生物成像和治疗研究。具体包括下列内容:(1)传统的光动力治疗技术光穿透组织不够深,同时光敏剂不具有靶向能力而产生副作用。因此,开发一种高选择性和准确定位的方法更好地控制光激发光敏剂产生单线态氧显得极为重要,以提供更有效的光动力治疗手段,减少副作用。在第二章中,我们基于设计分子间形成G-4结构的核酸适体功能化的上转换发光纳米材料构建了一种特异性靶向生物成像和光动力治疗的的纳米诊疗探针。通过设计将sgc8核酸适体的序列5’端延伸出一条可以分子间形成G-4结构的富G碱基的短序列,形成的G-4结构可以装载光敏剂TMPyP4。再将该序列5’端修饰的巯基通过sulfo-SMCC交联剂共价交联到上转换发光纳米材料表面。当该纳米探针进入到目标细胞后,用近红外光激发上转换发光纳米材料后发射出来的可见光通过发光共振能量转移激发光敏剂产生单线态氧,对目标细胞产生光毒性。(2)油酸包裹的疏水上转换发光纳米材料(UCNPs)在生物应用之前需要进行转水相,文献中报道的利用Lemieux-von Rudloff试剂进行转水相耗时较长。因此,我们仔细研究Lemieux-von Rudloff试剂氧化烯烃中的碳碳双键的机理后,设想是否可以通过适当调节Lemieux-von Rudloff试剂中的KMnO_4和NaIO_4试剂的用量比例,来加速氧化UCNPs表面油酸配体的时间。在第三章中,我们通过调节Lemieux-von Rudloff试剂中的KMnO_4和NaIO_4试剂的用量比例,在UCNPs表面原位生长了可以猝灭其荧光的沉淀物,并成功将其转水相。然后,采取一系列的表征手段,鉴定出表面的生长物为二氧化锰,为构建新型的纳米诊疗探针提供了研究基础。(3)我们组已经报道使用二氧化锰纳米片用于癌症基因沉默治疗,但是在活体研究中是采用活体瘤注射药品的,这是因为血液中也存在谷胱甘肽,如果通过尾静脉注射,二氧化锰在血液循环中会提前被降解,导致副作用的产生。为了保护二氧化锰纳米材料在进入目标细胞之前不被血液中的谷胱甘肽还原,在第四章中,我们构建了一种新型靶向纳米诊疗探针用以保护二氧化锰。在第三章构建的复合材料UCNPs@MnO_2表面包裹介孔二氧化硅可用于载药,用明胶纳米层堵住介孔硅的孔,最后在明胶表面修饰核酸适体,成功实现了对MnO_2在血液循环中的保护,使其只有在到达靶细胞之后,明胶被靶细胞的溶酶体酸性环境降解,导致药物的释放和GSH的进入,此时MnO_2才会被靶细胞中的谷胱甘肽还原为Mn~(2+),可用于核磁共振成像的造影剂。同时,MnO_2被还原后,UCNPs的荧光恢复,可实现靶向药物治疗和可激活式荧光成像。本章中构建的纳米诊疗探针不但能实现细胞内环境刺激响应的药物控制释放和靶向可激活双模式成像,而且某种程度上推动了二氧化锰纳米片在癌症诊疗中的发展。(4)除了光动力治疗和化疗,基因治疗也为许多疾病提供了一种可能的治疗手段。理想的基因治疗载体必须安全高效稳定地实现基因转染,即载体必须能够准确地递送和释放基因。因此,构建特异性针对肿瘤的靶向基因转染载体是基因治疗成功的关键。在第五章中,我们构建了基于核酸适体和腺相关病毒载体的靶向基因转染载体。该工作将组装有核酸适体的DNA树枝状结构与腺相关病毒(AAV2)通过含有二硫键的交联剂共价交联,可实现AAV2载体携带GFP基因的靶向转染,而且通过DNA树枝状纳米结构的多加效应,提高了核酸适体与目标细胞的亲和力。这种策略通过对AAV2进行化学修饰核酸适体,使得修饰后的载体能通过核酸适体介导的内吞机制感染目标细胞,可以解决AAV2载体只能感染硫酸乙酰肝素多糖蛋白阳性表达的细胞的缺点,可以拓宽AAV2载体在基因治疗中的应用。
【学位单位】：湖南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TB383.1
【部分图文】：

酸适体（aptamer）源于拉丁语 aptus，意为“适合”，是具有独特的对靶标有特异性识别能力的单链（ss）DNA 或 RNA 寡核苷酸。自ld 与 Ellington 分别针对噬菌体 T4 DNA 聚合酶[1]和有机染料[2]先后从中筛选出核酸适体。截至目前，已经有上千种核酸适体被报道，靶子[3]、有机小分子[2, 4, 5]、蛋白质[1, 6-13]、病毒感染细胞[13]、干细胞癌细胞[16-18]等等。通过氢键、静电、碱基对堆积作用和疏水等协同体折叠成特异的三维结构，在空间上可以特异性与靶标匹配，从而别靶标，结合常数 Kd 范围通常为皮摩尔到微摩尔，这一高度亲和作 1.1）使得核酸适体在生物医学肿瘤标志物鉴定、药物开发、诊断和战性且有着十分重要的潜在应用价值。核酸适体创始人之一 Larry 创办了 SomaLogic 公司，该公司主要致力于运用核酸适体来检测蛋个性化精准治疗。公司官网 http://www.somologic.com/Technology.as筛选出来的上千种单链核酸适体，可以用于检测不同生物分子功能的en 网 站 也 设 计 了 一 个 很 全 面 的 在 线 适 配 体 数www.aptagen.com/aptemer-index/aptamer-list.aspx。

基于核酸适体的多功能上转换纳米探针的研究EX 的基本步骤ELEX技术如图 1.2所示：①化学合成寡核苷酸文库，该文库苷酸，两翼为短的特定核苷酸序列，在 PCR 期间作为引物中将文库与靶标一起孵育；③通过一系列方法将未结合的物分离；④分离出来的与靶标特异性结合的核酸序列通过到的双链核酸序列拆分获得单链的次级寡核苷酸文库；⑥选，文库里与靶标结合能力弱的寡核苷酸序列被慢慢淘汰克隆测序并通过各种方法评估其与靶标结合动力学。当筛 DNA 不同的是引入了体外转录和逆转录步骤。SELEX 技子进化的过程在体外进行，但在筛选适体的实际操作过程及到的分离和鉴定技术的限制，影响筛选效率和效果。因进和发现新的 SELEX 技术。

博士学位论文平衡毛细管电泳技术（non-equilibrium capillary electrophoresis of equilitures, NECEEM）[22]、平衡混合物平衡毛细管电泳技术（equilibrium captrophoresis of equilibrium mixtures, ECEEM）[23]和扫描毛细管电泳（Swee技术，应用于核酸适体的筛选。
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本文编号：2862329