利用高盐毛发酸解液污水生产饲用酵母的研究
【摘要】 毛发酸解法提取氨基酸产生的污水是较难处理的工业污水之一，然而此类污水中又含有很多宝贵的资源。本研究利用高盐毛发酸解液污水生产饲用酵母，将污水中的资源转化为菌体蛋白，既回收大量有用物质，同时使污水达排放标准。首先，研究选用了5种微生物菌体吸附污水中的重金属离子。结果冬虫夏草菌对Cr吸附率最高，达96.4%，可使重金属达排放标准。其次，探索了物理化学、生物吸附法去除污水中的色素及Cl-。结果色素可被有效吸附，活性炭对其吸附率达66.2%。接着，选取12种饲料生产菌进行耐盐性驯化筛选，结果产朊假丝酵母能在N含量4.8%(w/v)的污水培养基中生长，在N含量3.2%(w/v)的污水培养基中形成菌落仅需2d。对其进行培养条件优化，结果为：培养时间3d，装液量50mL/250mL三角瓶，初始pH5.5，污水N含量3.2%(w/v)，玉米淀粉(酶解液)11%(w/v)，K2HPO42.0%(w/v)，酵母粉0.9%(w/v)，FeSO40.2%(w/v)，MgSO40.9%(w/v)，CaCO30.2%(w/v)，菌体得率达4.1%(w/v)，较优化前提高了128.7%。发酵后，污水中N含量降低了23.3%。说明产朊假丝酵母利用了污水中的部分营养成分，大大降低了饲用产朊假丝酵母的发酵成本，同时也减小了污水处理难度。最后，我们另从高盐环境中筛选到一株能在污水培养基中生长的酵母菌，用分子生物学方法鉴定为饲用汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)。经驯化后该菌能在N含量4.8%(w/v)的污水培养基中生长，在N含量3.2%(w/v)的污水培养基中形成菌落仅需1d。对其进行培养条件优化，结果为：装液量50mL/250mL三角瓶，初始pH5.0，种龄4d，培养时间5d，接种量10%(w/v)，污水N含量3.2%(w/v)，玉米淀粉(酶解液)7%(w/v)，KH2PO41.5%(w/v)，酵母粉0.3%(w/v)，FeSO40.6%(w/v)，MgSO40.5%(w/v)，CaCO30.2%(w/v)，菌体得率达4.9%(w/v)(相当于N含量9.67%(w/v)的高盐污水可转化成14.7%(w/v)的饲用菌体)，较优化前提高了48.5%。发酵后，毛发酸解液污水N含量降低了82.3%，达到了较好的处理效果。
第 1 章 绪 论
1.1 我国水污染现状
据调查，世界上能喝到安全饮用水的人不到 30%，每天约有 2.5 万人死于与水污染相关的疾病[1]。预计到 2050 年，世界上会有约 70 亿人面临缺水的问题[2]。2011年我国水资源总量[3]为 23256.7 亿 m3，为 1956 年以来最少的一年。人口数量的增长、农药喷洒、工业废水的乱排乱放等，造成了淡水资源的加剧短缺。工业污水为水污染的主要来源之一[3]，占污水排放总量的 32.3%。但是这只是官方统计数据，实际上，其排放量大大超过此数值[4]，因为许多企业工业污水排放量难以统计。
1.2 氨基酸厂废水特点
氨基酸工业污水有机物含量高、氨氮含量高、盐分高、酸性强，处理难度较大[5-7]。目前，生产氨基酸的企业大部分用强酸酸解人或动物的毛发，生产氨基酸单体工艺流程见图 1.1。吕墩氨基酸厂用毛发酸解法提取氨基酸的污水成分和理化性质参见表 1.1、表 1.2。
第 2 章 菌体吸附法去除毛发酸解液污水中重金属的研究
2.1 引言
重金属毒性大，在环境中不易被代谢，而且可以通过食物链被生物富集和生物放大[50-52]，一旦未经处理排放到自然界中，将极大地破坏生态系统，严重威胁水生生物的生存和人类的健康。本实验选用啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、根霉(Rhizopus)、毛霉(Mucor)、白地霉(Geotrichum candidum)、冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis)这 5 种吸附重金属能力较强的菌[53-57]，吸附污水中的 Pb、As、Hg、Cd、Cr。由于吕墩氨基酸厂污水中只有 Cr 超过了污水排放标准，因此，实验选取 Cr 为检测标准，筛选出重金属高效吸附菌。
2.2 实验材料
2.2.1 菌种
2.2.1.1 啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CICC 31362
2.2.1.2 冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis) CCTCC AF99009
2.2.1.3 根霉(Rhizopus) 湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室
2.2.1.4 毛霉(Mucor) 湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室
2.2.1.5 白地霉(Geotrichum candidum) CICC 32260
2.2.2 主要仪器与设备
第 3 章 物理化学、生物吸附法处理毛发酸解液污水的研究.....14
3.1 引言.............................................................................14
3.2 实验材料...................................................................... 14
3.2.1 菌种 ......................................................................... 14
3.2.2 主要仪器与设备...........................................................14
3.2.3 主要试剂 ................................................................... 15
3.2.4 溶液及培养基.............................................................. 15
3.3 实验方法........................................................................ 16
3.3.1 色度检测 .....................................................................16
3.3.2 Cl-检测.........................................................................16
3.3.3 冬虫夏草菌的制备........................................................ 16
3.3.4 冬虫夏草菌处理毛发酸解液污水.....................................16
3.3.5 活性炭处理毛发酸解液污水............................................16
3.3.6 壳聚糖处理毛发酸解液污水............................................17
3.3.7 聚丙烯酰胺处理毛发酸解液污水..................................... 17
3.4 结果与分析.......................................................................17
3.4.1 Cl-标准曲线....................................................................17
3.4.2 冬虫夏草菌处理毛发酸解液污水效果.................................18
3.4.3 活性炭处理毛发酸解液污水效果........................................18
3.4.4 壳聚糖处理毛发酸解液污水效果....................................... 20
3.4.5 聚丙烯酰胺处理毛发酸解液污水效果..................................20
3.5 结论................................................................................... 20
第 4 章 利用高盐毛发酸解液污水生产饲用产朊假丝酵母的研究......21
4.1 引言.................................................................................... 21
4.2 实验材料.............................................................................. 21
4.2.1 实验菌种 ...........................................................................21
4.2.2 主要仪器与设备................................................................. 22
4.2.3 主要试剂 .......................................................................... 22
4.2.4 溶液及培养基......................................................................23
4.3 实验方法.............................................................................. 24
4.3.1 玉米淀粉预处理.................................................................. 24
4.3.2 还原糖检测..........................................................................24
4.3.3 菌种筛选 ........................................................................... 24
4.3.4 菌种驯化 ........................................................................... 24
4.3.5 紫外诱变 ............................................................................ 24
4.3.6 种子培养 ............................................................................ 25
4.3.7 生长曲线的测定.................................................................... 25
4.3.8 装液量对高耐盐菌株生长的影响............................................. 25
4.3.9 初始 pH 对高耐盐菌株生长的影响............................................26
4.3.10 培养基成分优化................................................................... 26
4.3.11 高耐盐菌株处理毛发酸解液污水效果...................................... 26
4.4 结果与分析................................................................................26
4.4.1 还原糖标准曲线...................................................................... 26
4.4.2 菌种筛选结果.......................................................................... 27
4.4.3 菌种驯化结果........................................................................... 27
4.4.4 紫外诱变结果........................................................................... 27
4.4.5 产朊假丝酵母生长曲线的测定.................................................... 29
4.4.6 装液量对产朊假丝酵母生长的影响...............................................29
4.4.7 初始 pH 对产朊假丝酵母生长的影响........................................... 30
4.4.8 培养基成分优化......................................................................... 30
4.4.9 产朊假丝酵母处理毛发酸解液污水效果........................................ 36
4.5 结论..............................................................................................37
第 5 章 利用高盐毛发酸解液污水生产饲用汉逊德巴利酵母的研究............38
5.1 引言............................................................................................. 38
5.2 实验材料...................................................................................... 38
5.2.1 实验菌种 ....................................................................................38
5.2.2 主要仪器与设备.......................................................................... 38
5.2.3 主要试剂 ................................................................................... 39
5.2.4 引物 .......................................................................................... 40
5.2.5 溶液及培养基.............................................................................. 40
5.3 实验方法........................................................................................ 41
5.3.1 玉米淀粉预处理........................................................................... 41
5.3.2 还原糖检测.................................................................................. 41
5.3.3 菌种筛选..................................................................................... 41
5.3.4 菌种驯化 ......................................................................................41
5.3.5 高耐盐酵母菌的分子生物学鉴定..................................................... 41
5.3.6 种子培养 ..................................................................................... 43
5.3.7 生长曲线的测定............................................................................. 43
5.3.8 装液量对耐盐酵母菌生长的影响.......................................................44
5.3.9 初始 pH 对耐盐酵母菌生长的影响................................................... 44
5.3.10 种龄、摇瓶发酵时间及接种量的优化.............................................. 44
5.3.11 培养基成分优化............................................................................ 44
5.4 结果与讨论........................................................................................ 45
5.4.1 还原糖标准曲线绘制........................................................................ 45
5.4.2 筛选驯化结果.................................................................................. 45
5.4.3 分子鉴定结果................................................................................... 46
5.4.4 生长曲线的测定................................................................................ 52
5.4.5 装液量对汉逊德巴利酵母生长的影响................................................... 52
5.4.6 初始 pH 对汉逊德巴利酵母生长的影响................................................ 52
5.4.7 种龄、摇瓶发酵时间及接种量正交试验结果......................................... 53
5.4.8 培养基成分优化................................................................................. 54
5.4.9 汉逊德巴利酵母处理毛发酸解液污水效果............................................. 55
5.5 结论..................................................................................................... 56
第 5 章 利用高盐毛发酸解液污水生产饲用汉逊德巴利酵母的研究
5.1 引言
采集高盐环境的水样、土样，培养于高浓度毛发酸解液污水培养基中，以期筛选出对高盐污水具有高耐受力的优势饲用酵母菌株，将氨基酸转化为菌体蛋白，降低污水中的 N 含量，净化污水的同时，做到废物回收再利用。本章从高盐环境中筛选出的酵母菌, 再通过连续驯化培养进一步提高其耐盐能力，获得一株高耐盐酵母菌。运用了分子生物学方法，检测与分析从高盐环境中筛选出的酵母菌的 18SrDNA、26S rDNA 及 ITS 序列，鉴定其为可饲用的汉逊德巴利酵母，随后探索其最优生长条件，大幅提高其了对污水中氮源的利用能力。
5.2 实验材料
5.2.1 实验菌种大肠杆菌 Top 10 湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室
第 6 章 结论及展望
6.1 结论
⑴ 研究用 5 种微生物菌体吸附毛发酸解液污水中的微量重金属离子。结果冬虫夏草菌对 Cr 吸附率最高，达 96.4%，可使重金属达排放标准。⑵ 探究物理化学、生物吸附法去除污水中的色素及 Cl-。结果冬虫夏草菌、活性炭、聚丙烯酰胺及壳聚糖均不能有效去除高浓度 Cl-；活性炭吸附色素的效果较好，吸附率达 66.2%。⑶ 选取 12 种饲料生产菌进行耐盐性驯化筛选，结果产朊假丝酵母能够在 N含量为 4.8% (w/v)的污水培养基中生长，在 N 含量为 3.2% (w/v)的污水培养基中 2d 即可长出菌落。对产朊假丝酵母的培养条件进行优化，结果为：培养时间 3 d，装液量 50 mL/250 mL 三角瓶，初始 pH5.5，污水 N 含量 3.2% (w/v)，玉米淀粉(酶解液)11% (w/v)，K2HPO42.0% (w/v)，酵母粉 0.9% (w/v) ，FeSO40.2% (w/v)，MgSO40.9% (w/v)，CaCO30.2% (w/v)。在此条件下，菌体得率可达 4.1% (w/v)，较优化前提高了 128.7%。经产朊假丝酵母发酵后，污水 N 含量降低了 23.3%；添加的 11%(w/v)玉米淀粉酶解液经微生物部分吸收，部分分解后，上清还原糖仍有 3.78%(w/v)。⑷ 进一步从高盐环境中筛选鉴定到一株能在高浓度污水培养基中生长的汉逊德巴利酵母。经驯化，该菌能在 N 含量为 4.8% (w/v)的污水培养基中生长，在 N含量为 3.2% (w/v)的污水培养基中长出菌落仅需 1 d。其培养条件优化结果为：培养时间 5 d，装液量 50 mL/250 mL 三角瓶，初始 pH5.0，种龄 4 d，接种量 10% (w/v)，污水 N 含量 3.2% (w/v)，玉米淀粉酶解液 7% (w/v)，KH2PO41.5% (w/v)，酵母粉0.3% (w/v)，FeSO40.6% (w/v)，MgSO40.5% (w/v)，CaCO30.2% (w/v)。在此条件下，菌体得率可达 4.9% (w/v)，较优化前提高了 48.5%。经发酵后，污水中的含 N量降低了 82.3%；还原糖残留量 3.09% (w/v)。同产朊假丝酵母相比，汉逊德巴利酵母培养基中添加的营养物质更少，成本更低，而且对污水中的 N 源利用率更高，处理效果更好。
参考文献:
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本文编号：9584
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