莱茵衣藻高产油脂藻株的诱变筛选及其油脂代谢关键酶基因的转录分析

发布时间：2017-03-21 00:09

  本文关键词：莱茵衣藻高产油脂藻株的诱变筛选及其油脂代谢关键酶基因的转录分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：面对日益枯竭的化石能源和严重恶化的生态环境，生物柴油作为一种新型可再生的清洁能源，引起世界各国的关注。微藻能进行光合作用，生长速度快、油脂含量高、且培养占用耕地，被认为是最具潜力的油脂生物能源。但是生产成本较高，微藻能源至今未突破产业化这个瓶颈。本研究旨在通过诱变选育的方法获得生长速度快且油脂含量高的微藻，，并对其油脂代谢关键酶基因进行转录分析，探究其油脂含量增加的可能原因和途径，以期为微藻生物柴油高产油脂藻种的选育及在生产实践中应用基因工程手段进行藻株的改造提供数据基础。 本实验首先确定了紫外线照射时间（20s，25s）与喹禾灵筛选浓度（5.5，6.0μmol/L），采用紫外线诱变与喹禾灵胁迫相结合的方法对莱茵衣藻CC-124进行定向选育。通过测定生长速率初筛出5株生长速度较快的突变藻株，用尼罗红染色对限氮培养第4天的藻细胞油脂进行观察，挑选出了2株油脂颗粒大且数目多的突变藻株：4-2-2和9-2-7。采用酸解法测定了出发株和突变株限氮培养第0、4、6天时中性脂的含量，2个突变藻株都表现出高于出发藻株的中性脂水平。 利用GeNorm、BestKeeper和NormFinder三个内参基因筛选软件从18S rRNA、COX4、COX12、actin这四个候选内参基因中选出表达最稳定的COX12作为最适内参基因，对出发藻株、突变藻株4-2-2和9-2-7在限氮培养0、2、4、6天时4个微藻油脂代谢关键酶基因的转录水平进行了实时荧光定量PCR检测。这4个酶分别为乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、长链脂酰辅酶A合成酶（LACS）和二酰甘油酰基转移酶（DGAT）（包括DGAT1和DGAT2两个异构酶）。根据这些酶基因的转录水平分析及其相应的油脂含量，可以看出这两个突变藻株的油脂积累模式基本相同，都具有生长和油脂积累两方面的优势。尽管从中性脂含量看来，突变藻株9-2-7略高于突变藻株4-2-2，但后者在ACC基因和DGAT2基因表达上具有明显优势，有可能具有更持久的合成脂肪的能力。
【关键词】：莱茵衣藻 紫外线 喹禾灵 油脂合成 基因表达
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：TE667
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第一章 前言11-31
• 1 生物柴油概述11-13
• 2 微藻生产生物柴油13-25
• 2.1 影响微藻生长和油脂产生的因素13-15
• 2.3 微藻生物柴油的发展历程15-16
• 2.4 微藻生物柴油的优势16-17
• 2.5 微藻细胞中油脂合成途径17-20
• 2.6 几个在油脂合成过程中的关键酶20-25
• 2.6.1 乙酰辅酶 A 羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase，ACCase）20-23
• 2.6.2 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶23-25
• 3 微藻的遗传改良及其在生物能源上的应用25-28
• 3.1 诱变育种25-27
• 3.1.1 物理诱变育种25-27
• 3.1.2 化学诱变育种27
• 3.2 原生质体融合27
• 3.3 基因工程育种27-28
• 4 衣藻在能源微藻研究中的应用28-30
• 5 研究目的和内容30-31
• 5.1 本论文的研究目的30
• 5.2 本论文的研究内容30-31
• 第二章 喹禾灵对紫外诱变衣藻高产油脂藻株的定向选育31-46
• 1 材料31-33
• 1.1 实验材料31-32
• 1.2 培养基32
• 1.3 试剂32
• 1.4 仪器32-33
• 2 方法33-37
• 2.1 藻种的培养33
• 2.2 细胞密度的测定33
• 2.3 紫外线诱变辐射剂量的确定33-34
• 2.4 有效喹禾灵浓度的选择34
• 2.5 紫外线诱变与喹禾灵相结合对衣藻进行高油脂含量藻株的筛选34
• 2.6 突变藻株的筛选34-35
• 2.7 藻株油脂的尼罗红染色35
• 2.8 莱茵衣藻生长速率的测定35-36
• 2.8.1 正常培养条件下生长曲线的测定35-36
• 2.8.2 限氮培养条件下生长曲线的测定36
• 2.9 突变藻株在限氮培养条件下中性脂含量的测定36-37
• 3 实验结果与分析37-44
• 3.1 莱茵衣藻培养液 OD 值与细胞密度相关系数的确定37
• 3.2 有效紫外线照射剂量的确定37-38
• 3.3 有效喹禾灵筛选浓度的确定38-39
• 3.4 莱茵衣藻的诱变及定向选育结果39-40
• 3.5 根据生长速率对待测藻株的初筛40-41
• 3.6 尼罗红染色对突变藻株进行复筛获得高油脂突变藻株41
• 3.7 高油脂含量突变藻株的生长曲线比较41-42
• 3.8 限氮培养条件对衣藻生长速率的影响42-43
• 3.9 突变藻株在缺氮培养条件下的油脂含量43-44
• 4 讨论44-46
• 第三章 莱茵衣藻突变株油脂代谢关键酶基因的转录分析46-76
• 1 实时荧光定量 PCR 内参基因的筛选46-63
• 1.1 材料46-47
• 1.1.1 实验材料46-47
• 1.1.2 试剂与仪器47
• 1.2 方法47-52
• 1.2.1 莱茵衣藻总 RNA 的提取47-48
• 1.2.2 cDNA 第一链的合成48-49
• 1.2.3 引物设计及 PCR 反应条件的优化49-50
• 1.2.4 实时荧光定量 PCR 内参基因的筛选50-51
• 1.2.5 实验数据处理51-52
• 1.3 结果与分析52-60
• 1.3.1 莱茵衣藻总 RNA 提取52-53
• 1.3.2 引物检测结果53
• 1.3.3 检测合成的 cDNA53-54
• 1.3.4 实时荧光定量 PCR54-60
• 1.4 讨论60-63
• 1.4.1 内参基因的选择及不稳定因素60-62
• 1.4.2 莱茵衣藻突变株内参基因的分析62-63
• 2 突变藻株油脂代谢相关基因的表达分析63-76
• 2.1 材料63
• 2.1.1 实验材料63
• 2.1.2 试剂与仪器63
• 2.2 方法63-64
• 2.2.1 引物设计及 PCR 反应条件的优化63-64
• 2.2.2 目的基因实时荧光定量 PCR64
• 2.3 结果与分析64-72
• 2.3.1 引物的检测结果64-65
• 2.3.2 目的基因 ACC 实时荧光定量 PCR65-66
• 2.3.3 目的基因 PEPC2 实时荧光定量 PCR66-67
• 2.3.4 目的基因 LACS 实时荧光定量 PCR67-68
• 2.3.5 目的基因 DGAT1 基因实时荧光定量 PCR68-69
• 2.3.6 目的基因 DGTT1 基因实时荧光定量 PCR69-70
• 2.3.7 目的基因 DGTT2 实时荧光定量 PCR70-71
• 2.3.8 目的基因 DGTT3 实时荧光定量 PCR71-72
• 2.3.9 目的基因 DGTT4 实时荧光定量 PCR72
• 2.4 讨论72-76
• 第四章 总结与展望76-77
• 参考文献77-86
• 致谢86-87
• 个人简历87-88

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