青钱柳多糖的分离纯化与结构解析及其生物活性研究

发布时间：2017-05-05 12:00

  本文关键词：青钱柳多糖的分离纯化与结构解析及其生物活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】： 青钱柳[Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja]又名摇钱树，系胡桃科(Juglaruiaceae)青钱柳属植物。它是我国特有的单种属植物，广泛分布于安徽、福建、湖北、湖南、江苏、江西、四川、贵州、浙江等地的海拔420～2500 m的山区，是国家重点保护的濒危植物之一。其树皮、树叶可用于治疗糖尿病、高血压、高血脂。目前，青钱柳茶已得到美国食品与药品管理局(FDA)的认可，是我国第一个获得美国FDA颁发质量证书的保健茶。本文以江西修水的青钱柳为实验材料，综合应用食品科学、有机化学、天然产物化学、分析化学、生物技术及现代仪器分析等一系列现代研究方法和技术手段，较为系统地研究了从青钱柳中提取纯化出来的青钱柳多糖。对该多糖的含量测定、提取纯化、分子量、单糖组成、结构特点及部分生物活性进行了较深入的研究。本文对青钱柳多糖的提取、测定及生物学活性作用进行了较深入的研究，为青钱柳多糖作为功能性食品基料和用于新药开发的研究奠定了基础。主要研究内容与结论概括如下： 1．将蒽酮-硫酸法用于测定青钱柳多糖的含量。青钱柳用水提取，经多级处理除去脂类、单糖、双糖、低聚糖、氨基酸、蛋白质等杂质制得青钱柳精制多糖，精制多糖溶解后与蒽酮-硫酸试剂显色，通过扫描确定最大吸收波长，然后用精制多糖测得青钱柳多糖对葡萄糖的换算因子。结果表明，该测定方法简便可行，供试液在8 h内显色稳定，重现性较好，平均回收率为100.8％(RSD=1.90％，n=3)。所测江西修水青钱柳中多糖含量为4.387％。 2．将两种植物活性成分提取技术应用于青钱柳多糖的提取研究。以江西修水青钱柳粉末为原料，采用热水浸提法提取青钱柳多糖。研究了提取温度、提取次数、提取时间和料液比对青钱柳多糖得率的影响，并以提取次数、提取时间和料液比为考察因素，在90℃下，采用L_9(3~3)正交实验确定了热水浸提法提取青钱柳多糖的最佳工艺参数，即提取次数为3次，提取时间为150 min，液料比为1：8。在上述提取条件下，热水浸提法提取青钱柳多糖得率可达到6.54％。在单因素实验的基础上，利用Box-Benhnken中心组合实验和响应面分析法，确定了超声辅助提取青钱柳多糖工艺的最佳条件，即固液比为1：8，温度为58℃，时间为59 min，在此条件下青钱柳多糖理论提取值达到4.96％。 3．探讨了青钱柳多糖的脱色工艺。青钱柳粗多糖色泽很深，呈黑褐色，影响其分离纯化、化学结构、作用机理及构效关系的研究。本文研究了活性炭吸附法用于青钱柳粗多糖液脱色的的效果，探索活性炭吸附法用于青钱柳多糖脱色的可行性。分别以粗多糖液脱色率为指标，采用正交试验法对脱色的最佳工艺进行优选并考察活性炭吸附法对青钱柳粗多糖的影响。结果表明，活性炭吸附法对青钱柳粗多糖液具有良好的脱色效果，脱色的最佳工艺条件为：温度为40℃，吸附时间20 min，活性炭用量1.0％，pH值3.5。结论：活性炭吸附法用于青钱柳多糖的脱色效果良好，且简便易行。 4．研究了青钱柳多糖的纯化工艺及理化性质。本文首次运用Sephacryl-400葡聚糖凝胶层析柱与大分子纯化系统(?)KTA Purifier 100联用对青钱柳精制多糖进行纯化，得到一个主要多糖组分，该组分在示差检测器上监视的多糖吸收峰和紫外检测到的蛋白质特征吸收峰的最大值位置基本重叠，表明该组分可能是糖和蛋白的复合物，收集该组分，命名为CPC-1。将纯化所得青钱柳多糖CPC-1，经HPGPC法检测为均匀对称单一色谱峰，，以已知分子量的T-10、T-40、T-70、T-500标准葡聚糖和蓝色葡聚糖为标准作出标准曲线，采用HPGPC法测定了CPC-1的分子量，大小分别为1105859道尔顿。通过氨基酸自动分析仪法测定CPC-1中氨基酸种类及含量表明CPC-1中含有17种氨基酸成分，其中天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和精氨酸含量较高。通过GC以及GC-MS测定分析，CPC-1为一杂多糖，它由六种单糖组成，分别是鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，通过GC测定分析其摩尔比为10.64：31.23：3.23：8.72：30.16：16.02；其中，阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖的含量较高，木糖含量最低。红外光谱分析结果表明其具有典型的多糖特征吸收峰。 5．研究了青钱柳多糖的生物活性，包括体外抗氧化实验、抑制α-淀粉酶活力以及抑菌实验。青钱柳多糖对OH·自由基、O_2·清除效果相对较低，但对二苯代苦味酰自由基(DPPH)有显著清除作用，同时通过硫代巴比妥酸(TBA)法测得其对亚油酸具有抗氧化作用。青钱柳多糖对α-淀粉酶活力具有一定的抑制作用，当青钱柳多糖浓度为1.0 mg／mL时，抑制率达13％。青钱柳多糖对α-淀粉酶活力的抑制作用均随多糖浓度的增大而增加，这表明青钱柳的降血糖作用与青钱柳多糖的含量有关。用滤纸片抑菌圈实验法研究了青钱柳多糖对常见的几种菌的抑制作用。结果表明：青钱柳对酵母菌有明显抑制作用，对假丝酵母的抑制作用尤其强烈。多糖对细菌有明显的抑制作用，对黑曲霉、青霉和毛霉三种霉菌无抑制作用。
【关键词】：青钱柳 多糖 提取 分离 纯化 分子量 结构分析 生物活性 抗氧化 抗菌
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：TQ461
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 目录11-16
• 第1章 绪论16-40
• 1.1 青钱柳研究进展16-24
• 1.1.1 生物学特性与资源分布16-17
• 1.1.2 青钱柳资源培育17-18
• 1.1.3 化学成分研究18-20
• 1.1.4 青钱柳的生物活性20-24
• 1.1.5 青钱柳产品开发情况24
• 1.2 多糖研究进展24-37
• 1.2.1 多糖的来源与分布25-27
• 1.2.2 多糖的化学组成与结构27
• 1.2.3 多糖的生物活性27-31
• 1.2.4 多糖分析方法31-37
• 1.3 本文研究的目的意义、主要内容和创新点37-40
• 1.3.1 本文研究的目的意义37-38
• 1.3.2 主要研究内容38-39
• 1.3.3 本研究的创新性39-40
• 第2章 青钱柳多糖的含量测定40-48
• 2.1 引言40
• 2.2 实验材料与仪器40-41
• 2.2.1 材料与试剂40-41
• 2.2.2 仪器与设备41
• 2.3 实验方法41-43
• 2.3.1 青钱柳多糖的提取与精制41
• 2.3.2 标准曲线的绘制41-42
• 2.3.3 样品中青钱柳多糖含量测定42-43
• 2.4 结果与讨论43-47
• 2.4.1 精制青钱柳多糖的得率43
• 2.4.2 最大吸收波长的确定43-44
• 2.4.3 青柳多糖最佳醇沉体积分数的确定44-45
• 2.4.4 换算因子的测定45
• 2.4.5 吸光度测定的重现性和稳定性实验45-46
• 2.4.6 青钱柳中多糖含量的测定结果46-47
• 2.5 本章小结47-48
• 第3章 青钱柳多糖的提取工艺优化48-64
• 3.1 引言48-49
• 3.2 实验材料与仪器49
• 3.2.1 材料与试剂49
• 3.2.2 仪器与设备49
• 3.3 实验方法49-52
• 3.3.1 溶剂提取法49-51
• 3.3.2 超声波辅助提取法51-52
• 3.4 结果与讨论52-63
• 3.4.1 溶剂提取法实验结果52-56
• 3.4.2 超声波辅助提取实验结果56-63
• 3.5 本章小结63-64
• 第4章 青钱柳多糖脱色工艺研究64-75
• 4.1 引言64
• 4.2 实验材料与仪器64-65
• 4.2.1 材料与试剂64-65
• 4.2.2 仪器与设备65
• 4.3 实验方法65-67
• 4.3.1 青钱柳粗多糖液的制备65
• 4.3.2 单因素实验65
• 4.3.3 正交实验65-66
• 4.3.4 分析方法66-67
• 4.3.5 不同脱色方法的比较67
• 4.4 结果与讨论67-74
• 4.4.1 pH值对脱色效果的影响67-68
• 4.4.2 吸附时间对脱色效果的影响68-69
• 4.4.3 温度对脱色效果的影响69-70
• 4.4.4 活性炭用量的影响70-71
• 4.4.5 正交设计确定脱色的最佳工艺条件71-72
• 4.4.6 验证试验72-73
• 4.4.7 不同脱色方法的比较结果73-74
• 4.5 本章小结74-75
• 第5章 青钱柳多糖的分离、纯化及纯度鉴定75-94
• 5.1 引言75-76
• 5.2 实验材料与仪器76-77
• 5.2.1 材料与试剂76
• 5.2.2 仪器与试剂76-77
• 5.3 实验方法77-82
• 5.3.1 青钱柳多糖的提取77
• 5.3.2 青钱柳多糖的除杂77-79
• 5.3.3 膜分离技术分离纯化青钱柳多糖79-81
• 5.3.4 (A|¨)KTA purifier-100生物大分子纯化系统纯化81
• 5.3.5 纯度鉴定81-82
• 5.4 结果与讨论82-93
• 5.4.1 脱蛋白方法比较82-85
• 5.4.2 膜分离技术纯化多糖结果85-87
• 5.4.3 (A|¨)KTA purifier-100生物大分子纯化系统纯化结果87-90
• 5.4.4 纯度鉴定结果90-93
• 5.5 本章小结93-94
• 第6章 青钱柳多糖 CPC-1的分子量测定与理化性质研究94-113
• 6.1 引言94-95
• 6.2 实验材料与设备95
• 6.2.1 材料与试剂95
• 6.2.2 仪器与设备95
• 6.3 实验方法95-99
• 6.3.1 HPGPC法测定青钱柳多糖 CPC-1的分子量95-97
• 6.3.2 常压凝胶渗透色谱法测定CPC-1分子量97
• 6.3.3 CPC-1的基本理化性质97-98
• 6.3.4 流变学特性研究98-99
• 6.3.5 热重特性研究99
• 6.3.6 粒度分布分析99
• 6.4 结果与讨论99-112
• 6.4.1 HPGPC法测定CPC-1的分子量的结果99-104
• 6.4.2 常压凝胶渗透色谱法测定CPC-1分子量结果104-107
• 6.4.3 青钱柳多糖 CPC-1的基本理化性质107-108
• 6.4.4 流变学特性研究结果108-110
• 6.4.5 热重分析结果110-111
• 6.4.6 粒度分布测定结果111-112
• 6.5 本章小结112-113
• 第7章 青钱柳多糖 CPC-1的组成与结构表征113-140
• 7.1 引言113
• 7.2 实验材料与设备113-114
• 7.2.1 材料与试剂113-114
• 7.2.2 仪器与设备114
• 7.3 实验方法114-121
• 7.3.1 青钱柳多糖 CPC-1糖含量的测定114-115
• 7.3.2 青钱柳多糖 CPC-1蛋白质含量的测定115-116
• 7.3.3 青钱柳多糖 CPC-1氨基酸组成分析116-117
• 7.3.4 青钱柳多糖 CPC-1单糖组成分析117-120
• 7.3.5 糖醛酸含量测定120
• 7.3.6 紫外外光谱分析120
• 7.3.7 红外光谱分析120-121
• 7.3.8 ~1H-NMR光谱分析121
• 7.4 结果与讨论121-138
• 7.4.1 糖含量测定的结果121-122
• 7.4.2 蛋白质含量测定的结果122-124
• 7.4.3 氨基酸组成及含量测定结果124-127
• 7.4.4 青钱柳多糖 CPC-1单糖组成分析结果127-135
• 7.4.5 CPC-1中糖醛酸含量测定结果135-136
• 7.4.6 紫外光谱分析结果136-137
• 7.4.7 红外光谱分析结果137
• 7.4.8 ~1H-NMR光谱分析结果137-138
• 7.5 本章小结138-140
• 第8章 青钱柳多糖生物活性研究140-156
• 8.1 引言140-141
• 8.2 实验材料与仪器141-142
• 8.2.1 材料与试剂141-142
• 8.2.2 仪器与设备142
• 8.3 实验方法142-146
• 8.3.1 青钱柳多糖抗氧化活性实验142-144
• 8.3.2 青钱柳多糖抑制α-淀粉酶酶活力实验144-145
• 8.3.3 青钱柳多糖抑菌实验145-146
• 8.4 结果与分析146-155
• 8.4.1 青钱柳多糖对 DPPH自由基的清除作用146-147
• 8.4.2 青钱柳多糖对超氧阴离子的清除能力147-149
• 8.4.3 青钱柳多糖对清除羟自由基的能力149-150
• 8.4.4 青钱柳多糖对抑制 LPO的能力150-153
• 8.4.5 青钱柳多糖对α-淀粉酶酶活抑制效果153-154
• 8.4.6 青钱柳多糖抑菌效果154-155
• 8.5 本章小结155-156
• 第9章 结论与展望156-159
• 9.1 结论156-158
• 9.2 进一步研究方向158-159
• 致谢159-161
• 参考文献161-171
• 攻读学位期间的研究成果171

【引证文献】

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  本文关键词：青钱柳多糖的分离纯化与结构解析及其生物活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：346275