低温菌及其在环境工程中的应用

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低温微生物

34　　　　　　　　　　　东　北　林　业　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　　第31卷

和β-半乳糖苷酶等几种耐冷酶的基因已经被克隆并序列

化[12～15]。日本的Murata[16]的研究小组证实了蓝细菌C12去饱和酶的活性和耐冷菌在低温下生长之间的关系,他们从耐冷菌Synechocystis还克隆了C12去饱和酶desA基因,并且把它转到常温菌Anacystisnidulans中,使它具有活性去合成饱和脂肪酸(主要是C9、C12),同时能适应低温环境。甲苯降解质粒从嗜热菌P.putide中转移到耐冷菌P.putide中后,甲苯降解基因在低温下能够表达,在0℃可以生物降解甲苯[17]。至今为止,分子生物学研究的方向是分离出足够的蛋白,测序并进行蛋白晶体的研究。关于耐冷蛋白的生成和翻译规则方面还有待进一步的研究。4.2　冷激蛋白

,即一种。[突然转移到10℃时,会产CSPA,它结合于本,作为转座因子对冷诱导基因的表达起作用。在其它细菌中已经发现了它的同源蛋白,主要是在B.subtilis中发现的CspB蛋白,与CSPA有61%的相似性[19]。现已发现冷休克蛋白在原核和真核微生物中普遍存在,冷刺激的幅度越大产生的冷休克蛋白就越多。Ray[20]等以大肠杆菌的CSPA为探针,检测了分离自南极的耐冷菌中冷休克基因的存在及表达,发现有些耐冷菌在22℃和4℃时冷休克基因能经常表达,有些耐冷菌当温度从22℃突然降到4℃,1h后CSPA表达量最大。

除冷刺激蛋白之外,还存在第二类蛋白,称为冷适应蛋白CAPS,同冷刺激蛋白相比,CAPS在低温环境中是对应温度生长速度连续合成的。耐冷菌由于生活在温度波动的环境中,它们必须忍受温度的快速降低,这与它们生产的冷休克蛋白是密切相关的。冷休克蛋白不仅在原核生物和真核生物中广泛存在,并且发现它与真核生物的DNA结合蛋白具有很高的相似性。其详细功能有待于进一步阐明。在冷适应期间,至少有15种不同的冷休克蛋白被诱导合成。

明显是嗜冷性的,它在15℃以上失活,而当温度降至0℃时又

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快速恢复活性。此外,温度还通过影响核糖体上蛋白质的翻译速率或是通过影响某种专一mRNA翻译的起始或翻译的速率,来影响合成蛋白总量或特定蛋白的相对量[5]。Kra2jewska和Szer[6]证实:在嗜冷性假单孢杆菌中蛋白合成同中温菌和嗜热菌相比,在同样低温下有非常低的错配率。因此很明显,低温菌的一个适应性就是在它们的翻译机理中,具有在低温下保持有效启动的特殊能力,而在中温菌和嗜热菌系统中没有。

据报道,当嗜冷性微生物生长在它们底线温度时,蛋白质含量增多。Vckovski[7]的研究组用中温菌E.coli通过放射性标记细胞蛋白来判断生长在不同温度下的细胞蛋白的分离程度,发现当生长温度接近上限和下限时,蛋白组成有一些差异。这些蛋白在生长范围的中间部分是很稳定的,但当温度接近13.5℃和46℃时,蛋白质水平有所改变。

3　冷活性酶

,酶的作用。,而来。研究冷活性酶最早的是Morita,他报道了海产弧菌苹果酸脱氢酶在低于20℃时具有催化活性,温度超过20℃时则很快失活[8]。中科院从南极的嗜冷酵母中分离纯化的琥珀酸脱氢酶,其最适反应温度为20℃,在0℃能保持最大活性的60%。但当温度升高时冷活性酶即表现出对热的敏感性。如海洋弧菌细胞中的苹果酸脱氢酶于30℃处理10min,酶活力完全丧失;丙酮酸脱羧酶在35℃处理30min,酶活力损失90%[9]。

通过对淀粉酶、乳糖脱氢酶、脂酶和枯草杆菌蛋白酶等冷活性酶的空间结构和来自中温菌的相应酶进行比较,发现冷活性酶的分子适应机制似乎是氨基酸残基之间相互作用较弱,从而形成较伸展的分子结构,这种结构可在低耗能的情况下发挥催化作用[10]。Zuber{7}及其同事从耐冷菌Bacilluspsychrosaccharolyticus中分离出乳酸脱氢酶(LDH),随后进行了克隆及序列化,并将耐冷乳酸脱氢酶基因序列同中温菌、嗜热菌比较,证明耐冷LDH具有更多的极性、带电残基、更多的疏水表面及离子配对残基,这些变化使酶的活性中心更具柔韧性,并且在低温下更稳定。Gerday[11]的课题组对耐冷淀粉酶、蛋白酶和脂酶进行了分析,并同相应的中温序列进行比较,得到了相同的结果。

辛明秀[7]等认为嗜冷菌细胞中的代谢酶类在低温(0～)范围内表现出最大活性,与中温菌的相对酶类比较,嗜30℃

冷菌细胞中的代谢酶类在温度活性范围内偏向低温,如嗜冷酵母的己糖激酶、醛缩酶和琥珀酸脱氢酶与中温的酿酒酵母细胞中同类酶相比,其最大活性温度分别降低5、5～10和20℃,嗜冷菌细胞中的有些代谢酶类在低温下具有较强的底物亲和力。

自然环境中的大多数生物转化发生在相对低温下,因此低温菌群代表了一种潜在的酶资源,它在低温生物技术工艺上比中温酶和嗜热酶发挥更有效的作用。

5　冷适应微生物在环境工程中的应用

在地球上,冷环境占据很大面积,即使在热带地区,其冬天温度也较低。冷适应微生物在自然界中的分布十分广泛,其温度适应范围是0～30℃,与许多环境污染物所处的温度大致相同,因此在低温环境中,它们对于有机污染物的降解起到了十分重要的作用。Cooney分析了3个淡水湖中影响烃类降解的因素,认为温度的降低抑制了烃类的降解。Atlas分析了北极海洋冰层、水和沉积物生态系统中生物间的相互影响,认为低温下的北极海洋冰层中的生物降解是可以忽略的。但以后的研究者应用人工筛选出的具有降解能力的耐冷微生物,经实验证实,在低温条件下绝大部分有机物均可被耐低温的微生物降解。

Chevalier[21]从南极和北极分离到4株耐冷的丝状蓝细菌Cyanobacteria,它们在低温下对氮和磷有较高的去除率。At2lasBossert和Leahy[22]从土壤、淡水和海洋系统中分离的微生物能广谱利用自然环境中存在的各种石油烃类污染物,并将其作为唯一的能源和碳源.Whyte[23]分离了Rhodococcussp.Q15菌株,这种菌在0℃和5℃条件下能高效降解多种短链烷烃及十六烷、二十八烷、三十二烷等。Jarvinen[24]等进行了氯酚类的生物降解研究,他们从地下水中分离到的耐冷高效氯

4　嗜冷菌的分子生物学研究

4.1　基因的克隆

同嗜热菌相比较,对嗜冷菌的分子基因研究很少。耐冷性酶α-淀粉酶、蛋白酶、脂酶、乳酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶

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