海洋主要污损生物幼虫早期附着的分子定量方法研究

发布时间：2017-10-20 09:28

  本文关键词：海洋主要污损生物幼虫早期附着的分子定量方法研究

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【摘要】：海洋污损带来的问题日益突出,而环保型防污技术的研发方兴未艾。新型环保技术的着手点之一是基于表面微纳米结构的纳米防污技术,这类纳米涂层可以有效地抑制主要污损生物幼虫(藤壶、牡蛎、贻贝、苔藓虫、海鞘、盘管虫等)的附着。早期的海洋污损生物幼虫是肉眼不可见的,因此本课题意在建立一种针对主要海洋污损生物早期幼虫的快速识别定量技术,有助于快速鉴定微纳米结构涂层对污损生物幼虫附着的抑制作用。本课题首先在威海周边收集到几类主要海洋污损真核生物,分析它们的18S r RNA基因序列,寻找其SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)位点,并借助SAP理论技术(Simple Allele-discriminating PCR)设计物种特异性的引物,基本要求是在10种主要污损生物之间进行区分,共设计10对特异性引物;另外在个别污损生物科、种、属之间进行区分,主要针对藤壶及苔藓虫,共设计9对特异性引物。随后对上述设计的引物进行了理论验证,包括(1)对污损生物纯样本模板的扩增产物进行测序;(2)对测序结果进行Blast分析;(3)在Silva数据库中检测引物的覆盖率,同时在汇总的分类信息中,通过查看具体的引物覆盖范围完成引物的理论评估。10种主要污损生物的各自引物都保留了科及以上分类层面的特异性。最后对上述引物的特异性进行了实验验证,包括(1)以纯样本为模板对引物特异性进行筛选,共筛选出10对引物;(2)以威海小石岛两次挂板取样得到的宏基因组作为模板对引物特异性进行验证并借助Gel-Pro凝胶分析软件完成相对定量分析;(3)最后选择特异性最强的引物TH1(藤壶)和Bug1(苔藓虫)以第三次挂板取样的混合样本为模板进行QPCR绝对定量,同时考察不同纳米涂层表面幼虫附着的情况。本研究的结论和创新点是:(1)上述引物设计方法基本可以保证其扩增特异性;(2)在国内防污领域率先建立基于核糖体RNA基因单个碱基差异的主要污损生物早期幼虫附着程度的定量测定方法;该方法将在后续研究中进一步完善并扩大到尽可能多的污损物种。
【关键词】：生物污损 核糖体RNA基因 SAP技术 纳米涂层 QPCR
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X55;X835
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第1章 绪论9-20
• 1.1 课题背景9-10
• 1.2 研究目的及意义10
• 1.3 国内外研究进展10-18
• 1.3.1 基于微纳米表面结构的防污技术10-14
• 1.3.2 主要污损生物的分子鉴定方法14-16
• 1.3.3 基于核糖体基因单个碱基差异识别物种的SAP技术介绍16-18
• 1.3.4 实时定量PCR18
• 1.4 课题来源和研究内容18-20
• 1.4.1 课题来源18
• 1.4.2 主要研究内容18-20
• 第2章 实验材料与方法20-32
• 2.1 样品来源20
• 2.2 实验仪器和试剂20-22
• 2.2.1 仪器和试剂20-21
• 2.2.2 数据库和软件21-22
• 2.3 研究方法22-32
• 2.3.1 特异性引物设计22-24
• 2.3.2 特异性引物的理论评估24-26
• 2.3.3 特异性引物的实验评估26-31
• 2.3.4 QPCR定量实验31-32
• 第3章 主要海洋污损生物特异性引物设计32-50
• 3.1 引言32
• 3.2 结果与分析32-48
• 3.2.1 主要海洋污损生物纯样本的收集32-36
• 3.2.2 特异性引物设计结果36-48
• 3.2.3 特异性引物稀释48
• 3.3 讨论48-49
• 3.4 本章小结49-50
• 第4章 引物特异性的理论评估50-67
• 4.1 引言50
• 4.2 结果与分析50-65
• 4.2.1 纯模板测序及Blast分析50-59
• 4.2.2 特异性引物与测序序列符合度评估59-64
• 4.2.3 Silva数据库理论评估64-65
• 4.3 讨论65-66
• 4.4 本章小结66-67
• 第5章 引物特异性的实验评估67-90
• 5.1 引言67
• 5.2 结果与分析67-89
• 5.2.1 特异性引物筛选结果67-73
• 5.2.2 挂板试验73-74
• 5.2.3 特异性引物的验证及相对定量74-85
• 5.2.4 挂板混合样本模板验证85-89
• 5.3 讨论89
• 5.4 本章小结89-90
• 第6章 污损幼虫附着的初步QPCR定量分析90-99
• 6.1 引言90
• 6.2 结果与分析90-97
• 6.2.1 挂板试验90
• 6.2.2 QPCR定量结果90-97
• 6.3 讨论97-98
• 6.4 本章小结98-99
• 结论99-100
• 参考文献100-105
• 附录105-114
• 攻读学位期间申请的专利114-116
• 致谢116

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本文编号：1066520