羧基裂解酶基因在施氏假单胞菌N2代谢苯酚过程中的作用研究

发布时间：2017-10-24 06:34

  本文关键词：羧基裂解酶基因在施氏假单胞菌N2代谢苯酚过程中的作用研究

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【摘要】：苯酚是普遍存在于环境中常见的污染物,目前已分离出诸多能以苯酚为唯一碳源和能源的菌株。对细菌中苯酚羟化酶、邻苯二酚邻/间位开环裂解酶研究较为充分。而苯酚羧化是启动苯酚代谢的主要途径之一,目前仅有厌氧条件下羧化的报道。本课题组前期分离获得一株快速降解苯酚的菌株—施氏假单胞菌N2,在好氧代谢时常产羧化中间产物。本文旨在调取其羧基裂解酶基因,构建基因工程菌,研究并揭示相关基因在降解苯酚过程中的作用。本论文以野生施氏假单胞菌N2为研究对象,利用分子生物学技术构建羧基裂解酶基因突变株,以液相色谱、气相色谱-质谱联用仪及其紫外光谱等分析技术,研究野生菌株及其突变株代谢苯酚的差异性,揭示了ubiX和ubiD基因在施氏假单胞菌N2降解苯酚过程中的作用,获得以下成果:(1)发现施氏假单胞菌N2中ubiD和ubiX两个基因目前功能并不明确。利用分子生物学技术成功构建施氏假单胞菌N2两株羧基裂解酶基因单突变株N2ubiD-、N2ubiX-和双突变株N2ubi X-ubiD-等基因工程菌。(2)研究发现缺失ubiD和ubiX基因降低菌株抵抗苯酚毒性和降解苯酚的能力,尤其是缺失ubiX基因使菌株前期代谢苯酚的能力明显下降。缺失基因ubiD则不易以间位开环裂解方式降解苯酚,而缺失基因ubiX则不易以邻位开环裂解。尽管野生菌和突变菌以苯酚为唯一碳源生长时,均能通过羟化和羧化启动苯酚的代谢,并产“顺,顺-己二烯二酸”和“2-羟基粘糠酸半醛(2-HMS)”开环裂解中间物,但仅野生菌株与单突变株N2ubiX-代谢苯酚时,易检测到羧化+还原反应转化的开环裂解产物,说明ubiD易在细胞中产生还原能力。(3)共存乙醇和丙酮等碳源能提高双突变菌株N2ubiX-ubiD-抗苯酚毒性及代谢苯酚的能力,使其在后期,生长速度加快。而共存乙醇能加快N2菌野生株及其突变株对苯酚的降解与转化。共存乙醇均能同时诱导各菌株中“邻苯二酚1,2-双加氧酶”和“邻苯二酚2,3-双加氧酶”。而缺失ubiX基因的突变株,因乙醇共存可明显减少降解液中顺,顺-己二烯二酸和2-HMS的积累量,说明这两个中间产物被该菌株进一步降解转化速度较快。
【关键词】：施氏假单胞菌N2 羧基裂解酶基因ubiX和ubiD 苯酚 邻苯二酚双加氧酶 开环裂解途径
【学位授予单位】：西安建筑科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X172
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 1 绪论10-20
• 1.1 苯酚的结构特点、性能、污染现状及危害10-12
• 1.1.1 苯酚的结构特点及其性能10
• 1.1.2 环境中苯酚来源及污染现状10-12
• 1.1.3 苯酚的危害12
• 1.2 苯酚物理化学处理技术研究现状12-14
• 1.2.1 物理法及其优缺点12-13
• 1.2.2 化学法及其优缺点13-14
• 1.3 苯酚的微生物降解研究现状14-17
• 1.3.1 苯酚降解菌的研究现状14-15
• 1.3.2 共存碳源对微生物降解苯酚的影响作用15
• 1.3.3 苯酚降解机理及研究现状15-17
• 1.3.4 微生物修复苯酚污染环境的优势17
• 1.4 施氏假单胞菌降解苯酚的研究现状17-18
• 1.4.1 施氏假单胞菌的生理特性17-18
• 1.4.2 施氏假单胞菌的代谢特性18
• 1.4.3 施氏假单胞菌N2对苯酚的降解性能18
• 1.5 本论文研究意义及内容18-20
• 1.5.1 本论文研究意义18-19
• 1.5.2 本论文研究的内容19-20
• 2 施氏假单胞菌N2羧基裂解酶基因突变菌株构建20-31
• 2.1 施氏假单胞菌N2菌羧基裂解酶基因突变菌株构建技术路线20-21
• 2.2 实验材料21-22
• 2.2.1 实验材料21-22
• 2.2.2 实验试剂及仪器22
• 2.3 实验方法22-27
• 2.3.1 PCR扩增施氏假单胞菌N2羧基裂解酶基因ubi X、ubi D22-24
• 2.3.2 施氏假单胞菌N2羧基裂解酶基因ubi D突变株的构建24-25
• 2.3.3 施氏假单胞菌N2羧基裂解酶基因ubi X突变株的构建25-26
• 2.3.4 施氏假单胞菌N2羧基裂解酶基因ubi X、ubi D双突变株的构建26-27
• 2.3.5 施氏假单胞菌N2羧基裂解酶基因突变菌株的培养验证27
• 2.4 实验结果27-30
• 2.4.1 施氏假单胞菌N2羧基裂解酶基因ubi X和ubi D片段的电泳结果27
• 2.4.2 施氏假单胞菌N2羧基裂解酶基因ubiX和ubiD自杀性质粒构建结果27-28
• 2.4.3 施氏假单胞菌N2羧基裂解酶基因单、双突变菌株的验证28-30
• 2.5 小结30-31
• 3 施氏假单胞菌N2羧基裂解酶基因在苯酚降解中的作用研究31-50
• 3.1 材料与方法31-35
• 3.1.1 实验材料31-33
• 3.1.2 实验方法33-34
• 3.1.3 分析方法34-35
• 3.2 结果与讨论35-49
• 3.2.1 施氏假单胞菌N2及其突变株对苯酚毒性的响应特性35-36
• 3.2.2 苯酚对N2菌及其突变株邻苯二酚开环裂解酶的诱导作用36-39
• 3.2.3 施氏假单胞菌N2及其突变株降解苯酚中间产物分离与鉴定结果39-49
• 3.3 小结49-50
• 4 共存碳源对施氏假单胞菌N2及其羧基裂解酶基因突变株降解苯酚的影响50-59
• 4.1 材料与方法50-51
• 4.1.1 实验材料50
• 4.1.2 实验方法50
• 4.1.3 分析方法50-51
• 4.2 结果与讨论51-58
• 4.2.1 共存碳源对施氏假单胞菌N2及其突变株抗苯酚毒性的影响51-52
• 4.2.2 共存碳源对苯酚诱导各菌株邻苯二酚开环裂解酶的影响作用52-54
• 4.2.3 乙醇共存时施氏假单胞菌N2菌及其突变株代谢苯酚中间产物鉴定结果54-58
• 4.3 小结58-59
• 5 结论与展望59-61
• 5.1 结论59-60
• 5.2 建议60-61
• 参考文献61-66
• 致谢66-67
• 附录 硕士研究生学习阶段发表论文67

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本文编号：1087515