炔苯酰草胺降解菌的分离鉴定及酰胺水解酶基因的克隆与表达

发布时间：2018-04-15 10:34

  本文选题：炔苯酰草胺 + 生物降解　； 参考：《南京农业大学》2015年硕士论文

【摘要】：炔苯酰草胺是1969年美国罗门哈斯公司(RohmHaas)开发的一种芽后处理的内吸传导型选择性苯甲酰胺类除草剂,适用作物为苜蓿、大豆、豌豆、莴苣、棉花、向日葵等,对一年生、多年生杂草和某些阔叶杂草有很好的抑制和铲除效果。因为炔苯酰草胺除草活性高又对哺乳动物低毒,所以被广泛使用。但是过度、频繁的使用炔苯酰草胺,引起了一些环境问题。因此,寻求能够把炔苯酰草胺残留从环境中消除的有效策略是很有必要的。生物降解被认为是消除环境中污染物的主要因素。目前已经分离到了许多能够降解有机污染物的微生物,但是关于炔苯酰草胺的降解菌的研究未见报道.本研究从长期受农药污染的土壤中分离出能够快速降炔苯酰草胺的菌株W1,根据表型特性、生理生化特征和16SrDNA系统发育分析,将其鉴定为睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testoteroni)。菌株W1最适生长温度和pH分别30℃和7.0,为好氧性生长,当NaCl浓度小于2%时,菌体生长良好。鉴定了菌株W1代谢炔苯酰草胺的中间产物为3,5-二氯苯甲酸,即该菌株降解炔苯酰草胺是依靠断裂酰胺键来实现的,而且它能进一步降解3,5--二氯苯甲酸。菌株W1其降解炔苯酰草胺的最适温度和pH分别为30 ℃和7.0。在该条件下,5%接种量的菌株W1在18 h内可将80 mg L~(-1)的炔苯酰草胺降解99%以上。但是该菌株不能降解包括敌稗、敌草隆、异丙隆、灭草隆、甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺在内的酰胺类除草剂。由于3,5-二氯苯甲酸的水溶性比炔苯酰草胺的水溶性高,所以当炔苯酰草胺被转化成3,5二氯苯甲酸时,在含有300 mg L~(-1)炔苯酰草胺的LB平板上会形成透明的水解圈。以此作为筛选标记,从W1的基因组文库中克隆出一个新的酰胺水解酶的基因camH,该基因大小为1452 bp,编码483个氨基酸,G+C含量为49.30%。camH基因序列的Blast比对显示,在氨基酸水平上与推测的酰胺酶最高相似性为41%。活力位点分析发现CamH具有酰胺酶特征家族的保守的Lys-Ser-Ser催化中心。因此确定CamH是属于酰胺酶特征家族的一个新成员。成功构建了该基因的表达载体pET29a-camH;camH可以在E.coliBL21(DE3)中表达,重组酶CamH经Ni-NAT柱纯化后获得纯酶。炔苯酰草胺水解酶CamH的最适反应温度为30 ℃,最适反应pH值为8.0,具有较好的pH稳定性和热稳定性。CamH以炔苯酰草胺为底物时的K_m和V_(max)分别为0.889mM和0.161mMmin~(-1)。
[Abstract]:Phenylethyl oxalamide is a selective benzoyl amine herbicide developed by Rohm Haas. in 1969. It is suitable for alfalfa, soybean, pea, lettuce, cotton, sunflower and so on.Perennial weeds and some broad-leaved weeds have good inhibition and eradication effects.It is widely used because of its high herbicidal activity and low toxicity to mammals.However, excessive and frequent use of phenylethyl oxalamide has caused some environmental problems.Therefore, it is necessary to search for an effective strategy to remove acetyloxalicamide residues from the environment.Biodegradation is considered to be a major factor in the elimination of pollutants in the environment.Many microorganisms have been isolated which can degrade organic pollutants, but there is no report on the biodegradation of acetyloxalicalamine.In this study, a strain W1 was isolated from soil contaminated by pesticide for a long time. According to phenotypic characteristics, physiological and biochemical characteristics and 16SrDNA phylogeny, the strain W1 was identified as Comamonas testoteroniae.The optimum growth temperature and pH of strain W1 were 30 鈩，

本文编号：1753769