环境中磺胺类抗生素及其抗性基因的污染特征及风险研究

【摘要】 近年来,“速生鸡”“有抗奶”等事件的不断曝光,不仅触动了公众在食品安全领域的敏感神经,同时抗生素抗性基因等新型环境污染物也逐步引起了广泛关注。磺胺类抗生素是畜牧业和水产养殖业中广泛使用的抗菌药物,具有高水溶性、低螯合能力和低结合常数等特点,施用于动物后大部分会以原药或代谢物的形式经动物粪便和尿液排出并最终进入环境。它们在环境中的残留和长期存在,将胁迫微生物产生耐药性,并可能通过基因水平转移方式传递到其他菌群,进一步通过食物链传递到人体,威胁人类生命安全。长期以来,由于对抗生素的环境危害认识不足,我国对兽药抗生素一直缺乏有效的环境管理。本文以磺胺类抗生素作为代表品种,揭示磺胺类抗生素的环境污染特征,明确粪源引入磺胺类抗生素的环境归趋,探明环境中磺胺类抗生素耐药菌及抗性基因分布特征以及与抗生素暴露浓度的相关性,为我国建立兽药抗生素环境安全性评价体系提供基础数据与技术支撑。本文选择磺胺嘧啶,磺胺甲嘧啶,磺胺二甲嘧啶,磺胺二甲氧嘧啶和磺胺甲嗯唑五种磺胺类抗生素作为研究对象,通过文献查阅、养殖场调研、采样分析、室内实验、统计分析等多种方法,研究了养猪场、奶牛场、养鸡场三类典型的污染场景下磺胺类抗生素的暴露水平与纵向归趋规律,并与四环素等其他常用抗生素进行了比较；考察了粪肥的添加、土壤pH值、有机碳含量等因素对磺胺类抗生素在五种不同土壤(东北黑土,江西红壤,太湖水稻土、陕西潮土、南京黄棕壤)中的降解、吸附和淋溶影响；研究了施用粪肥对土壤中微生物种群和抗性基因的影响,揭示了磺胺类耐药菌中的抗性基因分布规律；最后建立了定性表征兽药环境健康风险的程序和方法,同时筛选得到我国兽药环境优先管理清单。主要研究结果如下：(1)研究发现,养殖场普遍使用抗生素作为饲料添加剂以及治疗药物,导致动物粪便、养殖场农田土壤、蔬菜、水体、底泥、鱼体等暴露介质广泛检出抗生素原型药物。其中,鸡场的抗生素污染最为严重,其次为猪场。通过典型抗生素在养殖场暴露的归趋分析,发现这些药物在养殖场的污染特征与其物理化学及环境行为特性等密切相关。同时,对抗生素从粪便到土壤以及从土壤到植物的迁移进行了模型预测与验证,为揭示抗生素的迁移规律和预测抗生素的暴露水平提供了基础。通过对不同药物作为饲料添加剂的贡献比进行计算,表明正常剂量使用抗生素添加剂不是养殖场抗生素污染的最主要来源。(2)研究表明,五种磺胺类抗生素在不同类型土壤中的降解规律均能较好地用双指数函数方程描述。五种磺胺类抗生素在不同土壤中的降解趋势为：松沙土≈壤土>粘壤土；在江西红壤中,五种磺胺类抗生素的降解速率顺序为：磺胺甲嘧啶>磺胺嘧啶>磺胺二甲氧嘧啶>磺胺二甲嘧啶>磺胺甲嗯唑。避光条件下,粪便的加入使得降解速率明显加快,尤其是江西红壤-粪便混合基质中的降解速率变化最为显著。磺胺类抗生素光照条件较避光条件下降解半衰期差异不大。五种磺胺类抗生素在江西红壤、太湖水稻土、东北黑土、陕西潮土与南京黄棕壤中的吸附较好地符合Freundlich方程,五种磺胺类抗生素在供试土壤中吸附性大致排列顺序依次为：东北黑土≈无锡水稻土>江西红壤>南京黄棕壤≈陕西潮土。影响磺胺类抗生素土壤吸附性的重要因素是土壤有机质含量和土壤pH。研究发现,药物的极性越大,其在加入粪便的土壤基质中Kd值增高越多。根据疏水pH分区模型,pH在4-6.5范围内时对吸附影响不大。五种磺胺类抗生素在五种土壤中的淋溶速率为：陕西潮土>南京黄棕壤>江西红壤>无锡水稻土>东北黑土。五种磺胺类抗生素在土壤中的移动规律和土壤吸附性有明显的负相关关系。粪便对土壤淋溶性能有一定影响,能吸附磺胺类抗生素,减少其移动。通过GUS模型估算磺胺类抗生素在土壤中的淋溶能力,验证了粪便对降低磺胺类抗生素在土壤中的淋溶能力有一定的作用。(3)研究显示,土壤中耐药菌的数量与施肥与否密切相关。在所有分析的土壤样本中,芽孢杆菌属(Bacillus)检出率最高,占到43.88%,其次为假单胞菌菌属(Pseudomonas)和志贺氏菌属(Shigella),分别占11.39%和8.02%。以16srDNA基因为内参,利用荧光实时定量PCR技术进一步分析了各种土壤样品中3种磺胺抗性基因(sul1、sul2和sul3)的相对含量,结果发现：在施用过猪粪肥的土壤中,sull的相对含量明显高于sul2,而在施用过鸡粪肥的土壤中,sul2的相对含量明显高于sul1。sul1和sul2的相对含量远远高于sul3。另外,sul2基因的丰度以及总sul基因丰度与土壤中可培养细菌总数存在显著的正相关性,相关系数(R2)分别为0.95和0.65(p<0.05)。利用sul1、sul2、sul3特异引物对分离到的耐药菌染色体和质粒DNA上的磺胺抗性基因进行了分析,发现粪便样本中三种sul基因在的耐药菌染色体和质粒DNA检出率为100%；森林土壤样本仅基因组DNA上有sul2基因,可能sull和sul3是与养殖动物相关的基因；未施肥土壤样本中基因组DNA上有sul2基因,质粒DNA上存在sul1,sul2和sul3基因,说明质粒可能是抗性基因水平转移的载体。施肥土壤样本中,总体检出顺序为sul2> sull> sul3(p<0.05);养鸡场土壤耐药菌sul检出率大于养猪场；基因联合存在形式sul1+sul2, sul1+sul2+sul3检出率高,sul2+sul3极少见,sul1+sul3未见,联合基因的检出率与粪便施肥的频率和数量有关。利用RT-PCR方法考察了土壤中优势耐药菌菌株炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis SYN201, G+)和弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri NJJN802, G-)在含有不同浓度磺胺类药物的培养基中生长不同时间后抗性基因sul1、sul2和sul3的表达变化,结果发现：无论培养基中是否存在磺胺类药物,菌株SYN201和NJJN802中的3种磺胺类抗性基因均分别在培养72h或36h时出现一个表达峰,而在其他培养时间下不表达或表达量处于一个相对极低的水平；磺胺嘧啶的存在有助于提高此特征表达时间下抗性基因的表达水平,并呈现出明显的剂量-效应关系。(4)根据兽药进入环境的可能性和生态与健康毒性效应,对中国药典中收录的一般兽药活性成分进行了环境管理优先级排序。77种排序药物中有38种药物被分级为高风险,尽管有部分数据的缺失。通过分级结果,发现抗生素药物是最需要管理和关注的药物品种,占57.9%。另外,在水产养殖中广泛使用的杀虫剂消毒剂也是优先级别很高的一类药物。该风险分级的结果可以给环境管理部门的管理决策提供方向性指导,同时为进一步开展具体兽药风险评估工作筛选出重点的品种。 

第一章绪论

1.1兽药抗生素使用情况
近年来，抗生素在畜牧养殖业中扮演着重要的角色，它们不仅用于畜禽养殖中疾病的防控，同时，还被普遍用作饲料添加剂以提高养殖动物的生长速率，因此，抗生素的使用量在很多国家的养殖领域呈现出逐年增长的趋势。据不完全统计，全世界范围内的抗生素年使用量在2003年以前已高达100000到200000吨(Kummerer,2003)c根据美国FDA近期的一项调查：美国市场上销售的抗生素中有80%被应用于畜禽的养殖（PeeplesL，2012)；我国养殖业中抗生素的使用情况也不容乐观，作为世界上抗生素生产和使用最多的国家之一，2007年的一项调查报告显示：我国各类抗生素的年生产量210，000吨，其中46.1%被用于畜禽养殖业，相当于美国1999年畜禽养殖业使用量的4倍（Hvistendahl，2012)。以四环素类为例，金霉素年使用量高达71900吨，仅金霉素就比美国四环素类抗生素总年使用量高22倍。我国其他类型的抗生素（磺胺类，大环内酯类，喹诺酮类）使用情况与四环素类相似，其中一种抗生素年使用量就远高于其他国家同一整类抗生素总年使用量。美国是畜牧业生产的超级大国，各种畜产品的产量在世界上都居前列，因此对兽药抗生素的需求量也很高，兽药抗生素的使用量紧随我国之后。亚洲的韩国由于使用大量抗生素饲料添加剂（Kimetal，2008)，抗生素的使用量远远超过欧洲一些国家。欧洲各国由于在兽药抗生素使用监控体系较为健全，抗生素的使用量控制在一个较低的水平上。非洲的肯尼亚由于种植业的比重大，而畜牧业欠发达，各类抗生素年使用量均较低。大洋洲的新西兰家畜饲养以牛、羊、鹿等草食家畜为主，这些草食性畜类在畜产品总值中占90%以上，猪和家禽主要靠舍饲，至今所占比例较小，其兽药抗生素主要用于治疗禽畜疾病，很少作为饲料添加剂，使用量并不高（郭欣姘，王娜等，2014)。
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1.2国内外兽药抗生素环境污染状况
兽药抗生素可以通过药物生产排放、污水处理排放、处理未使用的或过期的药物、坡面径流、施用投喂过抗生素的牲畜的类便作为肥料等多个方式进入环境，其中，最主要途径为施用投喂过抗生素的牲畜粪便于农田（图1-2)，因此各类兽药抗生素的环境暴露水平与其在养殖业的使用情况、储存和施用幾便的具体操作密切相关。大多数兽药抗生素很难被牲畜的消化系统吸收，多以原药形式随粪便和尿液排出体外，甚至有些抗生素的排泄率甚至高达90% (表1-2)。以口服投喂畜禽四环素，四环素会很快地随着粪便和尿液以排放到环境中，有个别畜禽个体甚至能在相当长的一段时间内持续排出四环素(Winckler and Grafe, 2001)=对大多数畜禽来说，在施药两天后能在其排泄物会回收到72%活性成分(Wincklerand Grafe, 2001)。四环素，，土霉素，磺胺二甲啼唆，恩诺沙星，泰乐菌素等兽药抗生素在猪粪，牛粪，鸡粪中普遍地被检测到，其中四环素类的排泄率为69%-86%,擴胺类的排泄率为80%-90%，喹诺酮类的排泄率为30%-83.7%，大环内酯类的排泄率为50%-100% (表1-2)。
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第二章典型养殖场兽药抗生素污染特征

2.1引言
本研究选择养殖大省江苏为研究区域，依据江苏省的地理地形、经济发展特点和畜牧业分布特征，将江苏省划分为3个部分：苏南、苏中和苏北地区，分别在各地选择具有代表性的不同类型的养殖场（猪场、鸡场和牛场)，采用实地走访养殖场，査阅养殖场用药记录，查看养殖场药房或兽药存放房间或兽医配药间和饲料车间，并与养殖场兽医、饲养管理员和养殖场负责人分别进行交流，以核实养殖场用药情况；对其兽药使用、用量、使用方法、排放情况进行了调査。在此基础上，分别选取养猪场、奶牛场、养鸡场三类典型的污染场景，以江苏省宿迁泗洪某养猪场、江苏省南京市汤山地区某奶牛场、江苏省徐州某蛋鸡场等养殖场为研究对象，研究磺胺、四环素和氟喹诺酮等三类抗生素在养殖不同介质中的污染特征。

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2.2材料与方法

2.2.1主要仪器和设备
GPS导航仪；电池；1L细口棕色瓶；釆水器；漏斗式釆泥器，1L带柄塑料烧杯；生料带2盒；纟产子；封口袋；棉手套；乳胶手套；小推车；整理箱；记号笔；签字笔；标签纸；透明胶带；剪刀；卷纸；镊子；保温箱；冰袋；浓硫酸；滴管。四环素会与桂醇基或蛋白结合，并与金属离子形成螯合物，因此所有玻璃器皿清洗干净后必须使用饱和EDTA甲醇溶液荡洗。

2.2.2采样方法样品采集：
严格按照《采样方案设计技术规定》（GB12997-91)与环境监测技术规范中关于监测断面、监测点的布设原则来布点采集。分别于2011年11月和2012年6月在江苏省宿迁泗洪某典型养猪场采集其周边环境及生物样品。采集水样、底泥、土壤、饲料、蔬菜、猪肉、猪粪和鱼肉样品。饲料样品为该养殖场常用饲料，粪便样品为养殖场词养的牲畜粪便。采集的土壤样本为0?20cm的表层土壤，在直径50cni左右的范围内取样1kg左右，蔬菜样品和土壤样品采样地点相同。水样采集方法是使用采水器取0.5m处深度的水，收集于m棕色玻璃瓶内，使用硫酸酸化使pH值达到2±0.2。底泥样品使用釆泥器进行采集，采样点和水样相同。猪肉和鱼样分别釆自养殖场饲养的育肥猪和场区内的养鱼塘。本养殖场二年度共采集粪便样本10份，土壤样本32份，水体样本16份，底泥样本16份，蔬菜样本32份，饲料样本10份，猪肉样本6份，鱼体样本10份。
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第三章磺胺类抗生素的环境归趋特性........ 37
3.1 引言 ........37
3.2试验材料与仪器........ 37
3.3试验方法........ 39
3.4结果与讨论........ 44
3.5小结 ........59
第四章横胺类抗生素抗性基因污染特征........ 61
4.1引言........ 61
4.2 试验材料与仪器........ 62
4.2.1实验材料........ 62
4.2.2实验方法........ 62
4.3结果与讨论........ 66
第五章兽药环境风险评估技术........ 82
5.1引言........ 82
5.2评估方法........   83
5.3结果与讨论........ 88
5.4讨论 ........93

第五章兽药环境风险评估技术

5.1引言
兽药在世界各国的使用都较为广泛，它是保护动物健康福利，防止经济损失以及间接保证食品供应安全、维护公众健康的一项重要工具。然而，如前几章节所述，抗生素作为全世界用量最大的兽药，其潜在的环境与健康影响不容忽视。环境管理部门如何对这类污染物进行污染控制与风险防控，是一项迫在眉睫的任务。本章拟在前述兽药抗生素污染特征、环境行为以及抗性基因诱导研究的基础上，初步探索兽药的定性环境风险评估技术，从而筛选我国兽药优先环境管理清单，为环境管理部门下一步开展兽药的环境监管提供技术支撑。在英国，共计有411类兽药活性成分（AI)批准用于962种兽药产品（截止至2004年8/9月；NOAH, 2004)。其中包括抗菌剂、抗球虫剂、杀外寄生虫药、杀内寄生虫药、激素制剂及免疫产品等。根据批准用于兽药的抗菌类产品的已发布销售数据显示，2003年英国累计出售456公吨治疗用抗菌剂AI (其中的87-93%用于食品动物），241公吨球虫抑制剂AI，36公吨抗菌生长促进剂AI，以及2公吨治疗用抗原虫剂AI (VMD，2004)。其中，四环素占到了全部己出售治疗用抗菌剂的一半左右（46%，212公吨），甲氧节氨啼徒/横胺类药、P-内酰胺类药、気基糖昔类药及大环内酯类药分别占到了 20% (89公吨），14% (62公吨），4.6% (21公吨）及13% (60公吨）。所出售的治疗用抗菌剂（57%，261公吨）仅批准用于猪及家禽类（VMD, 2004)。
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结论

本文选择五种擴胺类抗生素（擴胺啼旋，磺胺甲暗徒，擴胺二甲啼徒，磺胺二甲氧啼旋，磺胺甲恶哩）作为研究对象，通过文献查阅、养殖场调研、采样分析、室内实验、统计分析等多种方法，研究了养猪场、奶牛场、养鸡场三类典型的污染场景下擴胺类抗生素的暴露水平与纵向归趋规律；考察了粪肥的添加、土壤pH值、有机碳含量等因素对磺胺类抗生素在五种不同土壤（东北黑土，江西红壤，太湖水稻土、陕西潮土、南京黄棕壤）中的降解、吸附和淋溶的影响；研究了施用粪肥对土壤中微生物种群和抗性基因的影响以及磺胺类耐药菌中的抗性基因分布规律；并建立了定性表征兽药环境健康风险的程序和方法，蹄选得到了我国兽药环境优先管理清单。主要研究结果如下：养殖场普遍使用抗生素作为饲料添加剂及治疗药物，导致动物粪便、养殖场农田土壤、蔬菜、水体、底泥、鱼体等暴露介质广泛检出抗生素原型药物。其中，鸡场的抗生素环境污染最为严重，其次为猪场。通过典型抗生素在养殖场暴露的归趋分析，发现这些药物在养殖场的污染特征与其物理化学及环境行为特性等密切相关。其中，擴胺二甲啼徒在不同介质中污染浓度的排序为：粪便>底泥>土壤>鱼肉>蔬菜>水体，四环素类的土霉素和金霉素在不同介质中污染浓度的排序为：底泥>粪便>土壤>蔬菜>水体>鱼体，水体中抗生素的污染浓度与污水排放口的距离呈明显的正相关关系。同时，对抗生素从粪便到土壤的迁移规律以及从土壤到植物的迁移规律进行了模型预测与验证，为揭示抗生素的迁移规律和预测抗生素的暴露水平提供了基础。通过对不同药物作为词料添加剂的贡献比进行计算，表明饮用水中的添加或注射以及超量使用抗生素添加剂可能是养殖场抗生素污染的主要来源。
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参考文献（略）