抗汞真菌的筛选鉴定及应用潜力的研究

发布时间：2019-03-07 16:03

【摘要】：随着社会经济与工业生产的飞速发展,土壤重金属污染问题日趋严重,严重威胁人类健康和社会可持续发展。生物修复作为重金属污染修复的有效手段正越来越受到重视,微生物以其独特的生理特性已被广泛地应用于生物修复领域。本研究利用Hg~(2+)选择性培养基,从土壤中分离、筛选获得耐受性较强的真菌,并通过形态特征及分子生物学技术进行菌种鉴定,对其培养条件、重金属耐受性和吸附性、病原菌拮抗作用及植物促生进行分析和研究,为其在重金属污染土壤修复中应用提供科学依据。耐Hg~(2+)真菌的筛选:在马铃薯葡萄糖液体培养基中进行富集培养、在含Hg~(2+)平板涂布初筛、划线纯化及高浓度Hg~(2+)传代培养复筛;菌株的分类鉴定采用传统形态学鉴定与现代分子生物学ITSr DNA测序相结合的方法;在菌株生长条件的研究中,利用菌丝干重法评价真菌的生长状况,采用单一因子变量确定菌株最适生长条件;在重金属特征方面,真菌的重金属耐受性效果由重金属离子对菌株的生长抑制率和半致死浓度(EC50)两个指标进行评价。真菌重金属的吸附性通过制备菌丝球,添加到已知浓度的重金属离子溶液中,对菌株重金属的吸附效率和吸附量进行测定,并对吸附过程进行函数拟合,分析其重金属吸附特征;在林木病原菌的拮抗试验中,利用平板对峙法研究绿色木霉和草酸青霉对栗疫病菌(Cryphonectria parasitic)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、腐皮镰孢(Neocosmospora rubicola Fusariumsolani)、尖孢镰刀菌(Fusarium Oxysporum)的拮抗作用,对其拮抗系数进行评价;最后利用水培法,研究在重金属胁迫下,通过绿色木霉发酵液、草酸青霉发酵液和生化黄腐酸稀释液浸种处理的小麦种子,与对照相比在发芽率、叶长、根长方面的变化,来评价菌株对重金属胁迫下的植物的促生作用。在Hg~(2+)浓度为300mg/L的PDA平板中分离得到六株真菌,编号为lys2015f1-lys2015f6,鉴定结果分别为绿色木霉(Trichoderma virens)、镰状支顶孢菌(Acremonium falciforme)、狗尾草旋孢腔菌(Cochliobolus setariae)、藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)和黄曲霉(Aspergillus flavus);选择其中两株生物安全性较高、植物促生作用较强,同时具有多种功能的绿色木霉和草酸青霉菌株,进行深入研究,确定其培养条件为:马铃薯葡萄糖液体培养基静置培养,最佳培养温度为28℃,最佳pH为7,最佳培养时间为96h。重金属耐受性测试结果显示绿色木霉对四种重金属的耐受性能力排序为Zn~(2+)Cu~(2+)Pb~(2+)Hg~(2+),绿色木霉对四种重金属的耐受性排序为Pb~(2+)Hg~(2+)Zn~(2+)Cu~(2+)。重金属Hg~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Pb~(2+)对绿色木霉的EC50值分别是158.07、464.02、229.33、209.59mg/L,草酸青霉的EC50值分别是580.47、572.88、231.85、2284.01mg/L。吸附试验结果显示绿色木霉对Hg~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Pb~(2+)的最大吸附率分别是36.01%、18.98%、20.32%、36.38%,草酸青霉对Hg~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Pb~(2+)的最大吸附率分别是43.32%、22.51%、30.71%、69.16%。两株菌株最大吸附率顺序一致,均为Pb~(2+)Hg~(2+)Cu~(2+)Zn~(2+)。通过函数拟合结果显示,吸附过程更加适合准二级吸附动力学模型。在拮抗试验中,绿色木霉对栗疫病菌、胶孢炭疽菌、腐皮镰孢菌、尖孢镰刀菌的抑制率分别达到100.00%、35.96%、37.40%、34.64%。草酸青霉对栗疫病菌、胶孢炭疽菌、腐皮镰孢菌、尖孢镰刀菌的抑制率分别达为100.00%、73.68%、63.41%、60.78%。两真菌对栗疫病菌的拮抗系数达到I级,其余病原菌的拮抗系数达到II级。在对小麦的促生作用方面,在重金属胁迫下,生化黄腐酸浸种处理对小麦的促进作用效果最好,有效组数17组,草酸青霉13组,绿色木霉5组。在重金属方面,对Zn~(2+)、Hg~(2+)胁迫下小麦的促生效果作用效果最好,有效组数为11和10组;对Cu~(2+)和Pb~(2+)胁迫下小麦的促生效果次之,有效组数均为7组。绿色木霉和草酸青霉可大规模人工培养,对病原菌具有较好的拮抗作用,具有较高的重金属耐受性和吸附性,可降低重金属对植物生长的影响,对植物起到促生作用。综上所述,两菌株在重金属污染土壤修复中具有较大的应用潜力。
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【学位授予单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X53;X172

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