嗜碱盐单胞菌菌株X3的氮代谢相关功能基因的研究

发布时间：2020-05-20 20:07

【摘要】：随着我国城镇化步伐的加快、工农业和养殖业的大规模发展,含有高浓度氮的废水排放量不断增加,造成大量氮素渗入地表和地下径流,而产生水体富营养化等问题,严重威胁着生态环境的平衡。在废水脱氮工艺中,生物脱氮较传统的物化法脱氮技术具有经济高效,操作简单,且不容易对环境造成二次污染的优势。本实验室前期分离纯化得到一株具备高效脱氮功能的细菌嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphila)X3,研究X3菌株的氮代谢相关机理,对日后该菌株在废水脱氮中的高效应用和探究该类菌在海洋氮循环中的地位都具有重要意义,本文通过酶活检测、PCR、qRT-PCR检测等方法,对Halomonas alkaliphila X3氮代谢途径及相关酶的存在和功能进行了验证,并利用多种软件对各基因编码的相应蛋白质的二级结构、3D结构和系统发育等进行了分析,主要结果如下:(1)通过PCR反应,验证全基因组测序预测到的nasA和narGYVJ的存在,未扩增到没有预测到AMO、HAO、Nap、Nir、Nos和Nor相关功能基因的片段,同时培养过程中,未检测到硝化反应的关键中间产物羟胺和反硝化反应产生的气体,因此初步判断Halomonas alkaliphila X3的氮代谢途径中不存在编码AMO、HAO、Nap、Nir、Nos和Nor等各种酶的功能基因,可能不存在硝化和反硝化路径,其对无机氮的利用是通过硝酸盐的异化和同化反应途径实现的,即分别在异化型硝酸盐还原酶Nar和同化型硝酸盐还原酶NasA的催化作用下,将硝酸盐转化生成亚硝酸盐,再转化成氨氮,再合成细胞物质的。(2)Halomonas alkaliphila X3氮代谢通路中存在异化型硝酸盐还原酶Nar,且具有表达活性。该酶催化硝酸盐转化到亚硝酸盐的反应,且酶活性为每克蛋白21.415 U。Halomonas alkaliphila X3中的Nar由α、β、γ和δ四个亚基构成,分别由为narG、narY、narV和narJ编码。基因簇narGYJV编码的蛋白功能区域中1-1246氨基酸属于NarG超家族,构成Nar的α亚基;1261-1752氨基酸属于DMSOR-beta-like超家族,构成Nar的β亚基,2061-2279氨基酸构成γ亚基,1802-2018氨基酸构成δ亚基。NarG、NarY和NarV的3D结构与PDB中大肠杆菌的1Q16模型的3D结构最接近,覆盖率达96-100%。系统发育树显示X3菌株中NarG在同菌属中遗传距离较近,与坎帕尼亚盐单胞菌(Halomonas campaniensis)和盐单胞菌属(Halomonas sp.)WN018的一致性最高,高达99%;NarG在不同菌属间虽然功能相似,但同源性较低。NarY与大肠埃希菌(Escherichia coli)中的氨基酸序列的同源关系较近,证明异化型硝酸盐还原酶Nar中不同亚基的演化方向和系统发育地位均不同。(3)Halomonas alkaliphila X3中存在同化型硝酸盐还原酶NasA;经拼接获得了其功能基因nasA全长为2739 bp的全序列;发现该基因具有表达活性,且其在好氧条件下的表达量高于厌氧条件下的;预测到Halomonas alkaliphila X3的NasA中存在固氮酶中都含有的Mo元素,且NasA中未预测到信号肽,证明其是胞内酶;NasA的氨基酸中13-587氨基酸属于Molybdopterin-binding超家族;594-712氨基酸属于MopB_CT超家族;847-896氨基酸属于NirB超家族。通过系统发育树分析,X3菌株的nasA基因与Halomonas campaniensis和Halomonas sp.TD01的同源性最高,nasA基因在不同的菌属之间的差异性较大,NasA的蛋白质3D结构与PDB库中硫酸盐脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)的硝酸盐还原酶(NapA)同源性较高。
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上海海洋大学硕士学位论文电泳检验结果，电泳条带清晰，并未弥散，证明已成功获DNA 样品，，可以进行后续实验。株中预测到的 narGYJV 基因簇各亚基基因和 nasA 基因的扩增，均获得单一目标长度的条带(图 2-1 b、c)，且经生物序列高度相符，从而验证了这两类基因的存在真实性。

X3 中 amo、hao、nap、nirK、nirS、nos 和 nor 各基因 Pvalidation of amo, hao, nap, nirK, nirS, nos and nor genes inarker, 1: 引物为 AMO1F/AMO2R, 2: 引物为 AMOB/AM物为 HAOⅠ1/HAOⅠ2, 5: 引物为 NAP1/NAP2, 6: 引物S/nirS6R, 8: 引物为 nosZ-F/nosZ1622R, 9: 引物为 norBF/对照A marker, 1: Primers areAMO1F/AMO2R, 2: Primers are A/HAO2, 4: Primers are HAOⅠ1/HAOⅠ2, 5: Primers are N/nirK 5R, 7: Primers are F3nirS/nirS6R, 8: Primers are nosZ9: Primers are norBF/norBR, 10: negative control证结果 X3 菌株培养基内羟胺浓度变化，如表 2-1 所示，度均接近零，无明显差异，且各时间间隔测得羟
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X703;X172

【参考文献】

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本文编号：2673133