建立东海几种重要赤潮藻的LAMP-LFD检测技术

发布时间：2020-05-25 11:28

【摘要】：近年来,近海水域的富营养化程度越来越严重,导致全球性赤潮的爆发次数日益增多。赤潮的爆发不仅威胁人类健康,造成渔业巨大损失,还引发严重的环境和生态问题。因此,建立高效、灵敏的赤潮微藻的检测方法很有必要。本论文以我国东海常见的3种赤潮藻,即强壮前沟藻(Amphidinium carterae)、链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)和米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)为目标,将环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)与横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)结合,分别建立其LAMP LFD检测技术。论文以目标藻转录内间隔区(internal transcribed spacers,ITS)或核糖体大亚基(large subunit,LSU)为检测靶标,首先通过基因组DNA提取和克隆测序获得靶序列,根据靶序列进行LAMP引物和检测探针的设计、合成与筛选;其次,建立目标藻的LAMP LFD检测体系,对LAMP反应体系进行优化;最后对LAMP LFD技术的特异性、灵敏度及实用性进行验证评估。对强壮前沟藻的ITS序列进行克隆,并用其设计1套LAMP引物及1条检测探针;对LAMP反应体系进行优化后用我国东海沿岸常见微藻作为受试对象,对LAMP LFD进行交叉反应测试,表明LAMP LFD对强壮前沟藻具有特异性;分别以强壮前沟藻基因组DNA和ITS克隆质粒为模板进行灵敏度测试,显示LAMP LFD的检测限分别为8.34×10~-44 ng·μL~(-1)和1.86×10~4 copies·μL~(-1),灵敏度均比常规PCR高100倍;模拟自然水样测试得LAMP LFD对目标藻的检测限为约10 cells·mL~(-1),灵敏度比常规PCR高10倍。对链状亚历山大藻ITS序列进行克隆,以其为靶序列成功设计3套LAMP引物(AcLF1、AcLF2和AcLF3),筛选确定最优引物AcLF2,并设计1条检测探针;用最优引物建立检测体系并进行优化;交叉反应测试显示LAMP LFD对链状亚历山大藻具有特异性;LAMP LFD对链状亚历山大藻基因组DNA和ITS克隆质粒的检测限为4.63×10~(-4)ng·μL~(-1)和1.26×10~4copies·μL~(-1),均显示其灵敏度比常规PCR高100倍;模拟水样测试显示,LAMP LFD对目标藻的检测限约为10~-11 cells·mL~(-1),灵敏度较常规PCR高100倍。克隆米氏凯伦藻ITS序列,并用其设计2套LAMP引物(KmLF1和KmLF2),用实验室前期获得的LSU序列再设计2套引物(KmLF3和KmLF4),对4套引物进行筛选确定最优引物KmLF3,并根据LSU序列设计1条检测探针;优化建立的LAMP体系;交叉反应测试得LAMP LFD能特异性地检测米氏凯伦藻;LAMP LFD对米氏凯伦藻基因组DNA的检测限为1.70×10~(-4)ng·μL~(-1),灵敏度较常规PCR高100倍,对米氏凯伦藻LSU克隆质粒检测限为6.21×10~3copies·μL~(-1),其灵敏度是LAMP和SYBR Green I染料的10倍,是常规PCR的1000倍;模拟水样检测得LAMP LFD检测限约为10~-11 cells·mL~(-1),其灵敏度是常规PCR的1000倍。综上所述,建立的LAMP LFD检测方法是一种快速准确的赤潮藻分子检测技术。
【图文】：

别进行 PCR、LAMP、LAM采集的自然海水来着山东省有目标藻种。通过浮游生物然海水混合，取 5 mL 藻细胞 104cells·mL 1密度的模拟 8 个梯度。使用一管式植物 粗提液为模板，分别进行常规，以对比验证 LAMP LFD 模电泳验证，，SYBR Green I 染一个有阳性结果的稀释度被取及浓度测定的基因组 DNA 通过 Ezup 柱

强壮前沟藻ITSPCR琼脂糖凝胶（1%）电泳图
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X835

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本文编号：2680083