【摘要】：随着工业的发展,大气颗粒物污染越来越严重,给人类健康造成极大危害。PM2.5是指空气动力学直径"f2.5微米的大气悬浮颗粒物,主要来自煤炭燃烧、机动车尾气及工业废气的排放等过程,是形成雾霾天气的主要原因。目前认为PM2.5毒性机理主要包括以下可能机制,PM2.5首先与肺上皮细胞作用,刺激后释放各种细胞因子,PM2.5还能进一步与细胞作用,释放活性氧自由基等,氧化损伤组织细胞。气道炎症发生的早期是以支气管上皮细胞的炎症反应开始的,炎症因子的改变则是PM2.5致炎症作用的主要原因之一。为推动我国大气污染与人体健康关系的研究,开展PM2.5的毒性机制研究是必要且迫切。本研究以Beas-2B细胞为研究对象,考察PM2.5对人支气管上皮细胞的毒性作用与机制,采用MTT比色法检测不同浓度下PM2.5对细胞生长的抑制情况;在显微镜下观察PM2.5对细胞形态的影响;通过NO、ROS荧光探针实验检测PM2.5毒染细胞后细胞内NO和ROS氧化应激水平的变化;通过Hoechst33258实验和流式细胞术检测不同浓度的PM2.5对细胞凋亡的诱导情况影响。为进一步研究PM2.5及其主要多环芳烃类成分荧蒽、芘及菲对人支气管上皮细胞的损伤作用和机制,选用PM2.5主要成分荧蒽、芘及菲为研究对象,采用MTT比色法检测不同浓度下荧蒽、芘、菲对细胞生长的抑制情况;利用Real-Time PCR检测其毒染细胞后细胞内炎症因子和白细胞介素相关细胞因子的mRNA转录水平表达的影响;应用Western blot方法检测其处理细胞后炎症因子相关信号通路NF-κB、p38MAPK及和Nrf2表达和信号通路激活作用,同时检测相关凋亡蛋白p53、Bcl2、Bax和caspase1、3、12的表达情况。最后,为阐明PM2.5的主要多环芳烃类成分荧蒽和芘在体内运输机制,以BSA为蛋白模型,采用紫外光谱法研究荧蒽,芘与BSA作用后BSA蛋白质中芳香族残基微环境的变化以及BSA分子的二级结构变化;采用荧光光谱法研究荧蒽、芘与BSA的相互作用及分子构象,通过公式计算荧蒽,芘与BSA距离,判断是否镶嵌到BSA分子内部;采用同步荧光光谱法测量最大发射波长的改变,研究检测荧蒽、及芘与BSA的相互作用后氨基酸残基的环境的相应变化;采用三维荧光光谱法描述酪氨酸和色氨酸残基的结构变化和多肽链结构的变化,判断荧蒽、芘在BSA分子内部的结合位点。结果表明,PM2.5可以显著抑制细胞增殖能力并存在剂量依赖性关系。镜下观察通过不同剂量PM2.5处理后的细胞形态从梭形变成圆形,细胞出现皱缩且细胞数目随浓度增加明显减少。并且随着PM2.5浓度的增加,细胞内NO和ROS荧光强度明显增加,表明PM2.5使氧化应激程度增加。Hoechst33258和流式细胞术实验结果表明,PM2.5可以有效的诱导Beas-2B细胞的凋亡,并存在一定的浓度依赖。Real Time PCR检测结果表明,PM2.5、荧蒽、芘及菲处理后细胞内炎症相关因子及白细胞介素表达均上调,表明PM2.5、荧蒽、芘及菲均能诱导炎症反应。Western blot检测结果表明,PM2.5可以激活p38MAPK、NF-κB通路,抑制Nrf2信号通路。研究还发现,荧蒽、芘、菲均的结果具有和PM2.5相同趋势仅部分凋亡相关蛋白未检测能够诱导炎症相关因子的表达,激活p38MAPK、NF-κB通路,抑制Nrf2信号通路。光谱研究表明,加入荧蒽和芘后分子内部的色氨酸和酪氨酸残基的疏水基团裸露同时BSA肽链伸展,紫外光谱表现为明显的增色效应以及改变了BSA分子的二级结构;荧光猝灭机制的探讨中通过Stern-Volmer方程计算出荧蒽和芘对BSA的结合特性均为静态猝灭,并且随着温度升高结合点和平衡常数均有下降也符合静态猝灭机制,再根据Forster的非辐射能量转移理论,计算出荧蒽和芘与BSA相互作用后与色氨酸之间结合距离r和能量转移效率E,二者与BSA色氨酸之间的结合距离r,表明它们之间发生能量转移的可能性很高。通过热力学公式计算在不同温度条件下,FLA-BSA和PYR-BSA的ΔG、ΔH、ΔS,并判断出表明相互作用力均是疏水作用。再通过同步荧光光谱法判断FLA和PYR对BSA中发光荧光团酪氨酸残基微区和色氨酸残基微区的影响。最后使用三维荧光光谱法确定结合位点是在BSA疏水腔,导致了疏水性微环境极性改变,最终引起BSA构象变化。综上所述,PM2.5及其主要的多环芳烃成分还可以导致细胞的毒性作用,并且能引发致炎症作用,激活p38MAPK、NF-κB通路,抑制Nrf2信号通路,PM2.5的部分成分在体内运输机制是通过与BSA结合实现。本研究为我国大气污染与人体健康关系的研究提供了一定的毒性致炎机制的理论基础和实验依据。
【图文】：
生光后 TBST 洗膜 10min。生液 30min 没过 PVDF 膜即可。膜 3 次，每次 10min，即可继续用封闭液孵育。2.4 实验结果与分析处理细胞后的 MTT 实验结果 比色法，检测不同浓度的 PM2.5 对 Beas-2B 细胞的 2-1 所示，同空白组相比 PM2.5 处理后的剂量组，随存活率呈明显下降并且存在剂量依赖关系。结果表支气管上皮细胞 Beas-2B 的生长，存在浓度依赖性。L 分别作为低、中、高浓度组进行后续实验。
图 2- 2 PM2.5 对 Beas-2B 细胞形态影响实验结果.5 处理后细胞内 NO 水平变化情况炎症反应进程每一个阶段都有产生，，其参与多种炎症信号相互作用。DAF-FM 本身有弱荧光，NO 与其反应后产生，空白组仅有本身探针的微弱荧光，随着 PM2.5 药物浓度增强并且有强烈荧光的细胞数目明显增加，以剂量依赖方 水平随着药物浓度的变化，表明 PM2.5 刺激 Beas-2B 细胞氧化应激程度也随着增强。
【学位授予单位】：辽宁大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R122
【参考文献】
相关期刊论文 前10条
1 胡彬;陈瑞;徐建勋;杨国胜;徐殿斗;陈春英;赵宇亮;;雾霾超细颗粒物的健康效应[J];科学通报;2015年30期
2 刘莎莎;敖登其木格;王红丽;胡永亮;黎卫平;宋伦;;PM2.5通过活化NF-κB途径诱导支气管上皮细胞中血管内皮生长因子的表达[J];军事医学;2015年05期
3 付友生;;沈阳某地区雾霾成分特征分析[J];环境保护与循环经济;2014年12期
4 蒋闰兰;肖佰财;禹娜;陈立侨;;多环芳烃对水生动物毒性效应的研究进展[J];海洋渔业;2014年04期
5 杨春辉;蔡虹;闫江舟;杨静波;孙美艳;孟秀香;麻彤辉;;土木香内酯对K562/ADR细胞增殖的抑制作用及其机制探讨[J];中华血液学杂志;2014年06期
6 王晓晨;吉爱国;;NF-κB信号通路与炎症反应[J];生理科学进展;2014年01期
7 谢元博;陈娟;李巍;;雾霾重污染期间北京居民对高浓度PM_(2.5)持续暴露的健康风险及其损害价值评估[J];环境科学;2014年01期
8 孙志豪;崔燕平;;PM_(2.5)对人体健康影响研究概述[J];环境科技;2013年04期
9 李译;宋伦;袁胜涛;;大气颗粒物致细胞损伤效应的分子机制[J];生物技术通讯;2012年04期
10 贺擎;丁文军;芮魏;张芳;;冬季和夏季PM_(10)和PM_(2.5)对人肺上皮细胞A549毒性的比较[J];中国科学院研究生院学报;2012年03期
相关博士学位论文 前1条
1 包海东;p38MAPK在槐耳诱导肝癌细胞凋亡及自噬中的作用[D];大连医科大学;2015年
相关硕士学位论文 前1条
1 丁晓洁;PM_(2.5)对人支气管上皮细胞毒性作用的初步研究[D];南京医科大学;2014年
本文编号：
2687396
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/huanjinggongchenglunwen/2687396.html
