核酸适配体键合硅胶整体柱的制备及对赭曲霉毒素A的分析应用

发布时间：2020-06-06 12:00

【摘要】：核酸适配体因具有高度特异性和专一性以及稳定性好、易于化学修饰、目标配体范围广等优点,广泛应用于环境检测及食品安全分析。本文通过“sol-gel”法制备巯基有机-无机硅胶杂化整体柱,以纳米金为连接媒介,制备了具有超高适配体覆盖密度的有机-无机硅胶杂化亲和色谱柱,实现了对赭曲霉毒素A的高灵敏度识别与检测。主要内容如下:第一章,文献综述。概述了毛细管整体柱的类型和研究进展,介绍纳米金整体柱的研究进展与应用,重点对核酸适配体的特点以及核酸适配体亲和整体柱的研究进展与应用进行的概述,并且对本论文的研究内容及意义进行介绍。第二章,以四甲氧基硅烷(TMOS)和巯丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)作为硅烷化试剂,制备了poly(TMOS-co-MPTMS)杂化硅胶毛细管整体柱;制备了不同尺寸大小的纳米金,通过柱后衍生纳米金和巯基核酸适配体,制备了Apt@AuNPs@poly(TMOS-co-MPTMS)杂化亲和整体柱。实验考察了所制备的杂化整体柱的组成、形貌结构、能谱分析以及红外光谱和机械稳定性表征。表征了核酸适配体在杂化整体柱上的修饰量,系统考察了基质柱渗透性及纳米金粒径尺寸对Apt@AuNPs@ poly(TMOS-co-MPTMS)杂化亲和柱纳米金修饰量及对目标物OTA富集、洗脱效果的影响。所制备的Apt@AuNPs@poly(TMOS-co-MPTMS)新型杂化亲和整体柱具有高适配体覆盖密度,可达3,494pmol/uL、稳定性强。第三章,基于AuNPs@poly(TMOS-co-MPTMS)柱,开展了核酸适配体杂化亲和整体柱对目标物OTA亲和性能研究。应用核酸适配体对OTA的特异选择性及高亲和作用力,考察了Apt@AuNPs@poly(TMOS-co-MPTMS)柱对OTA的识别作用;考察了所制备的亲和柱对目标物OTA的回收率,并优化了洗脱参数;考察了目标物OTA在亲和柱上的负载量以及亲和整体柱对目标物OTA的检测限,应用于啤酒等酒类样品中OTA的分析、检测以及杂化亲和整体柱的使用寿命测试。结果表明,所制备的Apt@Au@poly(TMOS-co-MPTMS)杂化亲和整体柱对OTA具有高特异识别能力,稳定性较好,使用寿命大于3个月,对标准溶液中的OTA回收率可达92.3±2.1%和92.5±0.5%(n=3),OTA负载量为9.75ng,未经大体积进样富集时检测限达到0.025 ng/mL。在加标酒样中杂化亲和整体柱对目标物OTA具有较高特异识别能力,在0.5-5 ng/mL的OTA加标浓度范围,啤酒样品中OTA的平均回收率在89.6±3.7%-91.8±1.6%之间;葡萄酒样品中OTA平均回收率在90.3±2.8-91.6±2.7%之间,回收率高。
【图文】：

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适配体需要通过一定的固载方式键合到某种载体上，常见的的载体有琼脂逡逑、微球、芯片、纳米粒子及毛细管整体柱材料等。整体柱柱具有通孔和微孔网络结构；逡逑质速率快；吸附容量高；良好渗透性，流通阻力小；制备简单，无需柱塞。结合核酸适逡逑体与毛细管整体柱的优势制备出的高效新型的亲和色谱固定相材料，在富集、纯化小分逡逑化合物、蛋白质等发挥重要作用，因而核酸适配体键合整体柱在色谱分析领域倍受研究逡逑的关注。目前，适配体在毛细管整体柱材料上键合技术主要包括：非化学键合技术［？７１］逡逑化学键合技术两种。逡逑．２．１非化学键合技术逡逑非化学键合技术是基于亲和作用力来实现适配体与色谱固定相载体的结合。目前，使逡逑该技术来制备核酸适配体整体柱较为成熟的是生物素－链霉亲和素法。逡逑链霉亲和素是一种四聚体蛋白，一分子的链霉亲和素可以与四分子的生物素高度特异逡逑的结合。Ｌｉｕ等［７２］研制了一类亲水性、光稳定性、生物相容性和高荧光链霉亲和素功能逡逑二氧化硅纳米粒子，制备过程如图１－４所示，链霉亲和素功能化二氧化硅纳米粒子的研逡逑利用经典连锁技术对反相蛋白质微阵列进行检测。该纳米粒子探针具有荧光性能较好、逡逑测灵敏度高线性范围宽、检测限低等优点。逡逑？逦＇逦厂逦ｒ￣￣￣ｚ．—）逡逑

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逑的覆盖密度，可达５６８邋ｐｍｏｌ／＾Ｌ。Ｐｉｃｈｏｎ等ｔ７５］同样借用戊二醛为连接媒介，成功制备了邋ＯＴＡ逡逑适配体功能化的杂化整体柱，如图１－６－Ｂ所示，实现了对目标物赭曲霉毒素Ａ特异性富集，逡逑平均回收率为８０％，，负载量可达５ｎｇ，并应用于啤酒实际样品中ＯＴＡ的分析检测。如图逡逑１－６＿Ｃ所示，Ｗａｎｇ等［％通过乙二胺在整体柱表面修饰上氨基，然后以戊二醛为连接媒介，逡逑制备抗溶菌酶ＤＮＡ适配体键合的有机聚合亲和整体柱，实现从鸡蛋清中选择性提取溶菌逡逑酶，具有较好的重现性，同时适配体的覆盖密度为２９０邋ｐｍｏｌ／＾Ｌ。但这些制备方法涉及多个逡逑步骤，需要整体柱进行反复修饰键合，以确保亲和材料上适配体的覆盖密度，这是相对耗逡逑时的。逡逑—ＯＨ逡逑Ａ逦一0Ｈ邋ＮＭ２邋ｌ￡％ｇａｔｔｉｒｒｆｄｒｔｊｄｅ邋’邋ｎ＾＾ＣＨＯ逦＿逡逑”ＮＭ２逦＾ＣＨＯ邋ＰＢ４＾00ｍＭ邋Ｎ？ＣＨ２０？ｄＭ邋ＫＣｉ逡逑一０？逦－ＯＨ逡逑Ｈｙｂｒｉｄ邋ｓｉｌｉｃａ邋ｍ
【学位授予单位】：福州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X836;O652.6

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