基于DNA等温信号扩增检测水环境中重金属离子的生物传感器研究

发布时间：2020-06-29 19:45

【摘要】：随着工业、农业和生活等人为性质的活动增加,重金属在水环境中富集情况逐渐加剧,人们的健康受到了严重的威胁。因此,为了有效控制重金属离子污染的危害,一系列较为传统的重金属离子分析技术,如原子吸收光谱法(AAS)和原子荧光光谱法(AFS)等,在水体检测中展开了大规模应用。然而,这些方法所需仪器较为精密,操作过程比较繁琐,需要专业科研人员操作,无法进行实际现场检测,急需一种快速、高特异、低检测限、低成本的分析技术来弥补这一不足。在此背景下,具有便捷、高效、低耗费等优良性能的生物传感器获得了研究者的广泛关注。因此,本课题利用汞离子(Hg~(2+))特异性的T-Hg~(2+)-T结构以及铅离子(Pb~(2+))对应的“8-17”DNAzyme,结合DNA等温信号扩增技术,构建了三种高灵敏和高识别效率的生物传感器,并成功应用于自然水体痕量重金属离子的检测中。主要的研究内容如下:内容一:以T-Hg~(2+)-T所特异的错配结构作为目标物汞离子的识别探针,在纯均相的环境中,构建了基于链置换反应以及核酸外切酶Ⅲ的汞离子比色生物传感器。本工作体系中,预先进行稳定杂交的双链由一条富含T碱基的单链和一条可与纳米金表面DNA短链结合的单链组成。汞离子存在时,另一条富含T碱基的单链通过错配的T-Hg~(2+)-T结构与双链发生链置换反应,诱导核酸外切酶Ⅲ所辅助的双重信号扩增过程。随着汞离子浓度增高,纳米金表面DNA短链大量减少,颗粒之间距离得到拉近。由于纳米金的表面等离子体共振效应,此时的样品溶液颜色逐渐地由酒红色变为蓝色。测得的吸收光谱中,吸收波长发生红移,吸光度逐渐降低。通过与已报道的汞离子分析方法比较,设计的比色生物传感器具有较宽的检测范围(1 nM到10μM)、较低的检测限(0.90 nM)、较快的检测时间(30分钟)和较为简便的操作步骤(一步反应过程),可用于实际水体痕量汞离子的检测分析中。内容二:反应的界面由纯均相转移到了电极表面,并继续利用核酸外切酶Ⅲ良好的酶切活性,构建了标记型的汞离子电化学生物传感器。用于形成T-Hg~(2+)-T特异识别结构的其中一条DNA链被巧妙地设计为发夹构型(尾端含有大量T碱基)。汞离子加入后,发夹链的尾端通过T-Hg~(2+)-T结构与单链杂交,诱导核酸外切酶Ⅲ催化的双重信号扩增过程。最终,大量亚甲基蓝远离电极表面,电化学信号大幅度降低。通过优化实验参数,电化学生物传感器对目标物汞离子的检测限低至0.227 nM(检测范围为500 pM到5μM),重现性和稳定性得到了提高,在实际水样中的检测精度也与原子荧光光谱法有着较好的一致性。因此,基于目标物诱导以及酶辅助的标记型电化学生物传感平台具有用于实际水样检测分析的潜力。内容三:沿用了第二项工作的电化学生物传感检测技术,基于催化发夹组装和纳米金架桥功能,构建了无核酸酶辅助和非标记型的铅离子电化学生物传感器。“8-17”DNAzyme的底物链被设计为稳定的发夹构型(切割位点位于发夹的环部),尾端通过10个腺嘌呤(A)在纳米金颗粒表面进行共轭连接。铅离子将底物链切割为两条DNA单链(一条单链游离,另一条单链继续连接在纳米金表面)。游离链与体系中的三个处于亚稳定状态的发夹探针交替杂交完成催化发夹组装过程,形成的分支的DNA聚合体与纳米金表面的DNA单链结合生成三维的DNA/纳米金网络体系并固定在电极上。电极表面的这些带有负电的DNA链能够依靠静电作用吸附带正电的三氯六氨合钌,带来强烈的电化学信号。与其他已经报道的检测铅离子的分析手段相比,以“8-17”DNAzyme特异识别诱导的三重信号扩增策略的电化学生物传感器对目标物铅离子在100 pM到5μM的浓度范围内的检测限可达到0.095 nM。因此,在没有任何核酸酶参与的条件下,设计的铅离子特异的非标记型电化学生物传感器为实际水样中痕量铅离子的分析检测提供了一个较为有力的新平台。
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TP212.3;X853
【图文】：

.1（A）T-Hg2+-T 错配结构[30]；（B）铅离子特异 DNAzyme[31]；（C）铅离子特异“8-17”DNAzym（D）铅离子特异“8-17”DNAzyme 作用机理[34]（2）比色生物传感器比色生物传感器（Colorimetric biosensor），DNA 为识别元件，可将生物信号学信号和视觉信号，即能够利用肉眼观测样品颜色的变化和通过仪器测量样品对目标物浓度进行定量分析，用时短，成本较低，整体操作便捷，用途广泛[351.2 为本课题组所在实验室使用的 UV2600 紫外可见分光光度计（岛津公司；日本

错配结构[30]；（B）铅离子特异 DNAzyme[31]；（C）铅离子特异（D）铅离子特异“8-17”DNAzyme 作用机理[34]物传感器器（Colorimetric biosensor），DNA 为识别元件，信号，即能够利用肉眼观测样品颜色的变化和通过进行定量分析，用时短，成本较低，整体操作便捷所在实验室使用的 UV2600 紫外可见分光光度计（

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本文编号：2734268