土霉素高效降解菌OTC-16的降解特性及耐药性初探

发布时间：2020-07-03 14:30

【摘要】：土霉素是四环素类抗生素中的一种,因其成本低、易使用,常在畜牧业中作为饲料添加剂来预防动物疾病并促进动物生长。然而土霉素在畜牧业中的广泛应用和不彻底降解,造成了普遍的环境残留和抗性基因扩散,严重威胁了人类生存和安全。自然环境中微生物降解是去除抗生素残留的主要手段。本研究在前期筛选获得一株能够降解土霉素的菌株OTC-16的基础上,利用传统结合分子生物学手段对该菌株进行了鉴定;从接种量、初始pH、温度等角度出发研究了菌株发挥降解效应的环境适应性;对在不同pH条件下菌株在土壤中降解土霉素的实际应用效应进行了评估;最后利用生物信息学手段挖掘了该菌株的相关耐药基因并对菌株的实际抗药性进行了测定。研究结果如下:(1)利用传统结合分子手段将该菌株鉴定为Arthrobacter nicotianae。除土霉素外,菌株OTC-16还在一定程度上对四环素和金霉素有降解作用。对菌株的作用机制初步研究发现,菌株OTC-16主要通过生化降解途径降低土霉素浓度而非简单的菌体表面吸附,而降解相关活性物质主要通过分泌于胞外发挥作用。研究了菌株OTC-16发挥土霉素降解效应的环境适应范围,结果表明OTC-16菌株在pH 6.0-10.0生长良好,对碱性环境有较强的适应性;对土霉素具有较高的耐受性,在土霉素含量0 mg·L~(-1)-500mg·L~(-1)范围,OTC-16菌株均能生长良好。其中在接种量、初始pH、温度和土霉素初始浓度分别为3%(v/v)、pH 9.0、30℃和150 mg·L~(-1)时,菌株OTC-16对土霉素的降解效果最好。(2)土壤模拟试验评估了菌株OTC-16在不同土壤中的应用效果。实验结果表明,本研究获得的降解菌OTC-16在碱性的土壤环境中去除土霉素残留具有独特的优势。培养10 d后,添加的降解菌对在酸性、中性和碱性土壤中的土霉素的降解率分别提高了16.0%,6.3%和40.7%,且添加菌株不会对上述土壤的理化性质有不良改变。添加粪肥和秸秆能够提高土壤中有机质含量,但是会抑制土壤中土霉素的降解。因此为解决这个矛盾,在生产实践中建议去除抗生素残留和改良土壤分时段进行。对土壤中的16S rRNA和18S rRNA基因丰度分析发现,降解菌OTC-16、粪肥和秸秆的添加均能显著增加三种土壤中细菌的数量,且粪肥的作用效果更明显;秸秆本身对土壤中细菌的增加作用不明显,但与降解菌混合施用后,在碱性土壤中细菌数量激增。降解菌OTC-16的添加对三种土壤中真菌的数量几乎没有影响,而粪肥和秸秆却能显著提高酸性和中性土壤中真菌的数量。(3)对土霉素降解菌OTC-16的全基因组测序表明,其基因组总长度为3 797 724bp;含有一个大小为3 643 989 bp的环状染色体和两个质粒(一为线形,一为环状,大小分别为123 894 bp和29 841 bp)。通过基因注释,共获得3 561个基因,其中耐药基因有23个,大部分分布在质粒上。通过耐药基因(ARDB)数据库注释,我们得知,OTC-16基因组中存在多种耐药基因TetV、Tet33、sul1、ant2ia、vanre、vanrc、cml_e6、cml_e8、catb3、cara。其中TetV和Tet33属于外排泵基因,而Tet33至今报道较少。耐药谱试验表明OTC-16菌株能够耐受土霉素、四环素、磺胺单甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑等15种抗生素。与经生物信息学手段预测的耐药基因基本具有一致性,实验初步揭示了菌株的耐药机制。
【学位授予单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X172;X53
【图文】：

土霉素,别名,化学结构式,抗生素

2图 1.1 四环素族 3 种抗生素的化学结构式Figure 1.1 Chemical structure of three antibiotics of tetracycline土霉素（Oxytetracycline，OTC）是 20 世纪 40 年代发现的四环素族成员，别名四环素、地霉素、地灵霉素、氧四环素等，分子式为 C22H24N2O9, 相对分子量.44，是一种广谱抗菌素。盐酸土霉素表观为淡黄色的结晶性或无定形粉末；在

土霉素,中间代谢产物,分子结构式,四环素类抗生素

长期堆放四环素药渣的土壤为来源驯化、筛选了四环素降解菌株。张树清等通过外源添加有益降解菌剂（芽孢杆菌），有效去除四环素类抗生素残留[57]；Maki 等在一个养鱼场底泥中分离得到了能够耐土霉素、强力霉素生长的的抗性菌，并且发现二者在其抗性菌作用下发生了明显降解[89]。Wen 等用一株白腐真菌的木质素过氧化物酶粗提液降解土霉素和四环素取得了良好的效果[90]。张欣阳等从某制药厂排污口的水样中分离筛选到 1 株具有高降解四环素能力的菌株 4002，经鉴定为 Advenella sp.，并对其降解性能进行了研究[91]。抗生素能够在土壤环境中长期稳定存在，环境中抗生素的降解方式和速度与抗生素种类及性质有关。四环素类抗生素在不同的环境介质中因环境条件的不同而发生一系列非生物或生物降解反应，研究其在不同介质中的降解方式、降解机理和影响降解的环境因子对于探索降低抗生素污染和减少残留的最佳途径具有重要的意义。1.3.3 四环素类抗生素降解途径及降解产物近年来，人们开始逐渐关注四环素类抗生素的降解途径及降解产物。事实上，土霉素的降解可能会伴随对环境毒性更大的中间产物的产生，因此对土霉素的降解途径及中间代谢产物分析更值得关注。

【参考文献】