辣根过氧化物酶的分子包埋及其去除环境激素中的应用

发布时间：2020-07-05 06:43

【摘要】：环境激素是一类外因性干扰生物体内分泌的化学物质,具有毒性大、稳定存在、难以降解等特点。寻找绿色、环保、高效去除环境激素的方法成了迫在眉睫的任务。辣根过氧化物酶(HRP)能够高效催化过氧化氢去除环境雌激素。但HRP稳定性差、底物耐受性低、pH适应范围窄等问题,限制了HRP在去除环境雌激素中的应用。分子包埋法是通过蛋白质表面的基团与修饰剂反应,再通过聚合法或吸附法对单个蛋白分子进行包埋,使蛋白质的活性和稳定性得到提高。本文利用分子包埋法,对辣根过氧化物酶进行化学修饰,进而引发自由基共聚,制备了含有HRP的纳米凝胶;进而探讨了纳米凝胶酶对环境雌激素去除的效果;最后研究碳二亚胺/N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(EDC/Sulfo-NHS)法对纳米凝胶酶稳定性的影响。本研究首先在辣根过氧化物酶表面进行分子修饰,引入双键的共聚单体。通过原位自由基聚合法将两性离子单体共聚在蛋白酶表面,形成纳米凝胶酶。其纳米粒径尺寸分布在20-100 nm,Zeta电位为-1.8 m V。经过分子包埋,其热稳定性也得到了明显增强,在50℃下,水浴180 min,其活性仍保持48%,而HRP的活性只有8%。通过米氏常数测定可得,分子包埋法基本不会改变辣根过氧化物酶对底物的亲和力。其次,本文尝试使用纳米凝胶酶对环境雌激素进行去除研究。选择苯酚、双酚A、4-氯苯酚、2,4-二氯苯酚和4-甲氧基苯酚为去除对象。在探讨H_2O_2对纳米凝胶酶催化氧化苯酚的影响实验中,H_2O_2最适浓度为1 mM。在探讨pH对纳米凝胶酶催化氧化苯酚的影响实验中,在pH 3.0到10.0之间有较好的催化活性,最适pH为9.6。在探讨纳米凝胶酶催化氧化酚类环境激素实验中,纳米凝胶酶与辣根过氧化物酶相比,对苯酚去除率提高了61.9%,对双酚去除率提高了33.2%,对4-氯苯酚去除率提高了29.8%,对2,4-二氯苯酚去除率提高了10.2%,对4-甲氧基苯酚去除率提高了60.2%。辣根过氧化物酶对不同的酚类去除的效果也不同,这与其催化机理和氧化产物有一定关系,但整体来看,分子包埋法提高了辣根过氧化物酶对酚类化合物的去除率。HRP表面氨基只有7个,但是羧基29个。本项目还尝试利用HRP的羧基进行双键的接枝反应。利用EDC/Sulfo-NHS对HRP的羧基进行活化,然后与含有氨基的双键分子(APMA、AA)进行反应,进而获得HRP大单体。研究发现,当APMA与HRP的投料比为10:1时,纳米凝胶酶的热稳定性比辣根过氧化物酶提高了17.5倍,其纳米粒径分布在100 nm。在探讨不同缓冲体系对辣根过氧化物酶进行分子包埋实验中,两步法的MES缓冲体系比PBS缓冲体系更容易得到热稳定性强的纳米凝胶酶,说明在MES缓冲溶液中APMA更容易接枝在辣根过氧化物酶表面。生物质谱分析表面,HRP-APMA比HRP-NAS和HRP-AA接枝了更多的双键,说明利用羧基接枝双键具有可行性。最后本文还将HRP-APMA-gel应用于靛蓝胭脂红的降解实验中,HRP-APMA-gel对靛蓝胭脂红的降解率比辣根过氧化物酶提高了32.5%。说明本文对辣根过氧化物酶进行分子包埋后,在染料废水处理中具有更强的催化降解能力。
【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X592
【图文】：

辣根过氧化物酶,活性中心结构

辣根过氧化物酶的活性中心结构

催化反应机理,活性中心结构,辣根过氧化物酶

HRP催化反应机理Fig.1-2TheCatalyticreactionmechanismofHRP

【参考文献】