高效木质素降解菌菌株的筛

发布时间：2020-07-07 10:55

【摘要】：木质素是一种高分子的聚合物,在自然界中的含量仅仅低于纤维素,作为苯丙烷的基本结构单元,其连接形式通过C-C键和C-O-C键相互连接,从而构成无规则的空间三维结构,因而在自然存在的状态下难以被降解。目前在利用微生物降解的同时,也使得能产生大量的降解木质素的酶对木质素进行分解转化,不单单可以治理环境污染的问题,而且可以合理利用自然界中的木质素资源。因此,利用合理的方法分离纯化木质素降解菌,探索产酶能力及发酵条件,构建高效表达漆酶基因工程菌并应用于生产实践显得尤为重要,这将大大加快木质素原料在工农业生产的利用步伐,同时也是制约环境污染的关键所在。试验一高产漆酶菌株的筛选及鉴定为了获得高产漆酶的菌株用于降解木质素,分别从新乡周边腐木堆积处、秸秆堆积处和造纸厂废水这些木质素含量丰富的地方取样。本研究以木质素为唯一碳源,初筛出42株对木质素具有降解能力的菌株,采用愈创木酚平板法对产漆酶的菌株进行复筛得到4株产漆酶能力较强的真菌菌株,通过生理生化及18 SrDNA序列分析对菌株进行鉴定,确定了2号菌株为疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria),6号菌株为粗毛革孔菌(Coriolopsis gallica),8号菌株为黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium),11号菌株为白腐菌(White rot fungi)。并通过液态发酵培养及ABTS法对漆酶活性木质素降解能力进行研究。试验二目的菌株产酶能力的比较及发酵条件的探索研究挑取筛选出来的四种真菌菌株于液体培养基中,制备粗酶液,并利用ABTS法每天测定上清液中的酶活力。试验表明,在经过培养6天后,8号菌株漆酶活力达到最高,为233.33 U/L。接下来以黄孢原毛平革菌为目的菌株为研究对象,利用液态发酵研究碳源、氮源、金属离子、pH、温度对其发酵产漆酶的影响,优化产酶条件。结果表明:该菌株的最优碳源为乳糖,最优氮源为酵母粉,最适铜离子浓度为0.6 mmol/L,最适温度为30℃,最适pH为4。在此条件下木质素去除率达到了84.7%,具有良好的降解木质素的能力,为进一步利用此菌株进行工业化生产奠定了基础。试验三黄孢原毛平革菌漆酶基因的克隆表达及蛋白的纯化为了获得高产漆酶的工程菌株,根据目前已知的黄孢原毛平革菌中的漆酶基因序列,设计特异性的引物,通过PCR扩增,可以成功的获得cds区为1680bp片段,送生工测序后对比发现此基因的序列与目前已公布的漆酶基因片段的同源性达98%,这就表明我们成功克隆到了该基因,将其命名为lac1680。在漆酶基因两段引入Nde I和Xho I进行酶切,将切下来的漆酶基因,通过pET-24a载体进行连接转化到大肠杆菌原核菌株中,得到基因工程菌。将我们得到的漆酶的氨基酸序列和GeneBank中现有的真菌漆酶氨基酸序列对比分析表明:该氨基酸序列与其它真菌漆酶蛋白序列有较高的序列同源性;通过对重组菌预表达的全菌裂解物进行SDS-PAGE,出现75KDa目的条带,表明诱导表达成功;预表达成功后,通过收菌,破碎,上样流出液进行NI-NTA的层析柱,对纯化洗脱下来的mco1-c-His6蛋白进行纯化;为了更进一步的验证这个条带就是所需的漆酶条带,我们通过WesternBlot方法,洗脱纯化后和浓缩后的溶液中在目的位置都出现了75KDa的目的条带,证明这个条带就是诱导纯化后的漆酶。并经纯化回收后,漆酶纯度在98%以上。通过酶学性质的探究,对比基因工程菌和黄孢原毛平革菌培养不同时间酶活力的比较,构建好的工程菌活力比原菌酶活力有明显的提高,提高了39%,为进一步利用工程菌株进行工业化生产奠定了基础,也为以后的应用指明了方向。
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X172
【图文】：

图 2-1 愈创木酚显色圈大小的比较Fig 2-1 Comparison of guaiacol color ring size表 2-1 不同真菌愈创木酚平板显色直径Table 2-1 Different fungi guaiacol plate color diameterer显色直径/mm Color diameter/mm1d 3d 5d 7d 0 0 9 21 0 0 7 11 0 10 32 61 0 0 0 12

酶时间的延长，在第九天时显色直径达可达到69 mm。形态特征示，2号菌株菌丝初为白色绒毛状，培养5天后出现由黄色向过培养至10天，分生孢子变为墨绿色，菌落成胶状。6号菌有的菌丝透明，薄壁，多扭曲，具锁状联合，有的菌丝无色菌株菌丝细长，分生孢子呈圆形，孢子具有厚壁；11号菌株，顶端有球形的顶囊，并含有球形的分生孢子。

8S rDNA 电泳检测图（M：DNA MaA electrophoresis detection chart (M:DNA解木质素的菌株，我们从特定的自其菌株的形态学及 18SrDNA 进行鉴为人们带来巨大的经济效益，同时水的处理方面也有一定的作用。不断地进步，分子生物学，基因工大量的木质素降解菌，但分泌表达模的应用到生产实践中[93]。本研奠定了很好的基础。已有研究表有活性的微生物加入秸秆中，经

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