某冶炼厂周围农田土壤中抗生素抗性基因分布及其影响因素

发布时间：2020-07-12 18:15

【摘要】：目的描述某冶炼厂周围农田土壤中抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes,ARGs)和可移动遗传元件(Mobile Genetic Elements,MGEs)的分布,并研究该农田土壤中抗生素、重金属、细菌群落等因素对ARGs分布的影响。方法1.采用高通量荧光定量PCR(High-throughput quantitative PCR,HT-QPCR)对8类共310种抗生素抗性基因(Antibiotics Resistance Genes,ARGs)和9种可移动遗传元件(Mobile Genetic Elements,MGEs)进行相对定量分析。以16S rDNA基因为内参,用ΔC_T方法计算相对丰度。2.采用超高效液相色谱-串联质谱检测该地农田土壤中5种抗生素(磺胺嘧啶、诺氟沙星、罗红霉素、四环素和氯霉素)的浓度;同时对土壤中8种重金属含量和5种理化性质进行检测。3.运用DGGE方法和Illunima Miseq方法分别分析土壤可培养细菌群落和总细菌群落。4.Excel 2010整理数据,SPSS 21.0分析数据的正态性。用SPSS 21.0进行主成分分析(principal component analysis,PCA)以及聚类分析(clustering analysis),用Canoco5.0软件和R软件进行冗余分析(redundancy analysis,RDA)。基于Spearman秩相关R~20.65和P0.05,采用Gephi进行网络分析。运用Pearson相关和Spearman秩相关分析抗生素、重金属、理化性质含量和可培养细菌总数与ARGs及MGEs相对丰度之间的相关性。结果1.ARGs和MGEs分布的检测7个土样总共检出149种ARGs,检出阳性率最高的是FCA类抗性基因,为77.8%,其次是氨基糖苷类抗性基因和磺胺类抗性基因,阳性率分别为61.1%,60.0%。距离工厂最远的G7土样检出的ARGs种类最多,为90种。7个土样中ARGs的相对丰度总和范围在1.09×10~(-2)~3.63×10~(-1)。在距离工厂最近的G1土样中,ARGs相对丰度总和为3.63×10~(-1),远高于其它土样。7个土样以磺胺类抗性基因的相对丰度总和最高,为3.44×10~(-1)。网络分析显示有13种万古霉素类抗性基因、14种四环素类抗性基因、3种磺胺类抗性基因、23种β-内酰胺类抗性基因、22种氨基糖苷类抗性基因、22种MLSB类抗性基因、21种FCA类抗性基因、30种其它/外排泵类抗性基因和5种MGEs的相对丰度之间存在关联(P0.05)。2.抗生素和重金属含量测定磺胺嘧啶、诺氟沙星、罗红霉素、四环素在7个土样中均被检出,氯霉素未检出。四环素含量在G7土样最高,为1738.534μg/kg,高于其它抗生素含量。除了Ni和Cr无污染外,6种重金属(镉(Cd)、铅(Pb)、砷(As)、汞(Hg)、铜(Cu)、锌(Zn))均存在超标现象。G1土样重金属污染最严重。3.细菌群落结果检测7个土样的可培养细菌总数范围在1.67×10~5~8.33×10~5个/g之间。DGGE分析可培养细菌群落,发现11个优势菌属,属于变形菌门和厚壁菌门。主成分分析和聚类分析表明,G1和G2可培养细菌群落结构相似,与其它土样有差异。RDA显示,四环素含量和Cu含量能够影响可培养细菌的群落结构(P0.05)。Illumina分析土壤总细菌群落,发现变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、绿弯菌门和芽单胞菌门的丰度较高。装甲菌门、迷踪菌门、绿菌门和拟杆菌门的丰度在7个土样中存在差异(P值均小于0.05)。热图显示,G1和G2土壤总细菌群落的优势菌属相似,与其它土样差异较大。RDA分析显示,四环素浓度和Cd、Pb、As、Hg、Cu、Zn含量对土壤总细菌群落结构有影响(P值均小于0.05)。4.抗生素、重金属、理化性质含量对ARGs和MGEs分布的影响Pearson相关和Spearman秩相关分析发现,4种抗生素(磺胺嘧啶、诺氟沙星、罗红霉素、四环素)含量共与26种基因(25种ARGs、1种MGE)的相对丰度相关。8种重金属含量共与33种基因(30种ARGs、3种MGEs)的相对丰度相关。5种理化性质(总磷、总氮、有机质、pH、含水率)共与36种基因(34种ARGs、2种MGEs)的相对丰度相关。5.细菌群落结构对ARGs和MGEs分布的影响可培养细菌总数与7种ARGs(mphA-01、adeA、mexE、mexF、oprJ、vatE-01、yceL/mdtH-01)的相对丰度相关。总细菌群落结构分析发现39种细菌菌门丰度与71种基因(67种ARGs、4种MGEs)相对丰度相关(P值均小于0.05)。6.抗生素、重金属含量及细菌群落结构对ARGs和MGEs分布影响的比较共有87种ARGs的相对丰度与土壤抗生素含量、重金属含量、理化性质、可培养细菌总数或细菌菌门丰度相关。5种因素各自单一作用下影响了36种ARGs的相对丰度,受两种及两种以上因素作用影响的ARGs种类数有51个。其中,单一受“细菌菌门丰度”因素影响的ARGs种类数最多,达25种(25/87,28.74%)。细菌菌门丰度与其他影响因素共同作用,又影响了另外42种ARGs的相对丰度,合计细菌菌门丰度共影响了67种ARGs的相对丰度,占ARGs总种类数的77.01%。单一受抗生素含量、重金属含量和理化性质等因素影响的ARGs种类数比较少,分别是4、1、3种,远远小于它们各自与其他因素联合作用时影响的ARGs种类数(分别是21、29、31种)。结论1.该农田土壤中检出ARGs的阳性率以FCA类抗性基因最高,其次是氨基糖苷类抗性基因和磺胺类抗性基因,相对丰度总和最高的是磺胺类抗性基因。各ARGs相对丰度与土壤总细菌群落结构、抗生素含量、重金属含量、理化性质和可培养细菌总数等因素有关,受土壤总细菌群落结构影响的ARGs种类数最多。2.土壤抗生素、重金属、理化性质和可培养细菌总数等因素可独自影响某些ARGs的分布,但更多可能是通过影响土壤总细菌群落结构实现对ARGs分布的影响。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X53
【图文】：

土样,种类

结果表 3.1 各土样中不同 ARGs 类型的检测阳性数（率%）n G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7omyn35 4(11.4) 4(11.4) 6(17.1) 7(20.0) 0(0.0) 4(11.3) 7(20.0acyne44 3(6.8) 4(9.09) 8(18.18) 8(18.18) 6(13.64) 6(13.64) 8(18.2onade5 2(40.0) 1(20.00) 1(20.00) 1(20.00) 1(20.00) 1(20.00) 1(20.0tatase54 10(18.9) 11(20.4) 13(24.1) 16(29.6) 5（9.3） 11(20.4) 15(27.oglyide36 7(19.4) 5(13.9) 14(38.9) 10(27.8) 6(16.7) 9(25.0) 14(38.SB 53 9(17.0) 7(13.2) 7(13.2) 13(24.5) 4(7.6) 4(7.6) 13(24.A 27 9(33.3) 12(44.4) 13(48.2) 13(48.2) 10(37.0) 10(37.0) 15(55.erlux56 16(28.6) 11(19.6) 13(23.2) 18(32.1) 7(12.5) 8(14.30) 17(30. 310 60(19.3) 55(17.7) 75(24.2) 86(27.7) 39(12.6) 53(17.1) 90(29.

相对丰度,土样,抗性基因

图 3.2 各土样 ARGs 相对丰度和 MGEs 相对丰度分布（n=7）mycin：万古霉素类抗性基因；Tetracycline：四环素类抗性基因；Sulfonamide：；Beta Lactamase：β-内酰胺类抗性基因；Aminoglycoside：氨基糖苷类抗性基环内酯类-林可霉素类-链阳性菌素 B 抗性基因；FCA：喹诺酮类-氯霉素类抗性基其它/外排泵类抗性基因；MGEs：可移动遗传元件。

相对丰度,抗性基因,热图,土样

图 3.2 各土样 ARGs 相对丰度和 MGEs 相对丰度分布（n=7）万古霉素类抗性基因；Tetracycline：四环素类抗性基因；Sulfoa Lactamase：β-内酰胺类抗性基因；Aminoglycoside：氨基糖苷类-林可霉素类-链阳性菌素 B 抗性基因；FCA：喹诺酮类-氯霉素排泵类抗性基因；MGEs：可移动遗传元件。

【参考文献】