久效磷对斑马鱼（Danio rerio）胚胎发育的毒性效应及其机制研究

发布时间：2020-07-14 06:59

【摘要】：有机磷农药具有一定的胚胎毒性,能够影响胚胎的发育。实验室之前的研究发现久效磷暴露斑马鱼胚胎能够影响其生殖腺的发育,导致卵巢内生殖细胞形态和排列的异常。为进一步探究久效磷对斑马鱼胚胎发育的毒性效应,本文统计分析了久效磷对斑马鱼胚胎存活率、孵化率、心跳、畸形情况(心包囊肿和骨骼弯曲)、运动行为(自发运动)以及生长水平(头长和体长)的影响,首先从个体水平上探讨了久效磷的胚胎毒性。多种基因参与调控了斑马鱼胚胎的发育,久效磷暴露斑马鱼导致的心包囊肿、脊柱弯曲和性腺结构异常可能是因为其影响了发育相关基因的表达,而外源物质能够通过改变基因启动子区的甲基化水平来影响基因的表达。因此,本文进一步研究了久效磷暴露斑马鱼胚胎对心脏发育基因(Tbx2)、肌肉发育基因(Mef2c)和性腺发育基因(Vasa) mRNA表达水平的影响,以及久效磷暴露斑马鱼对Vasa基因启动子区甲基化水平的影响,从分子水平探讨了久效磷对斑马鱼胚胎发育毒性的潜在机制。本文研究结果表明：(1)0.0004、0.004、0.04和0.4mg/L的久效磷暴露斑马鱼胚胎至96hpf (hour post fertilization),对胚胎的存活率、死亡率、头长、体长以及自发运动均无显著影响。久效磷暴露显著降低了36hpf斑马鱼胚胎的心跳,升高了96hpf仔鱼心包囊肿和脊柱弯曲的百分比,说明久效磷具有胚胎毒性,主要表现为致畸性,能够影响斑马鱼心脏和骨骼的发育。(2)0.0004、0.004、0.04和0.4mg/L的久效磷暴露斑马鱼胚胎至96hpf,采用实时定量PCR(real-time PCR)检测48和60hpf心脏发育相关基因T盒子2(Tbx2)、肌细胞增强因子2C(Mef2c),以及48、60和96hpf性腺发育相关基因Vasa(DEAD-family protein of ATP-dependent RNA helicase) mRNA的表达水平。研究结果表明,久效磷暴露降低了48hpf胚胎Tbx2基因的表达水平,而对60hpf胚胎Tbx2基因表达水平无影响；暴露升高了48hpf胚胎Mef2c基因的表达水平,但是,对60hpf胚胎Mef2c基因表达水平无影响,说明久效磷可能是通过影响Tbx2和Mef2c基因在心脏发育关键期内(48hpf内)的表达水平,进而影响心脏的正常发育。另外,久效磷暴露对96hpf胚胎Vasa基因表达水平无影响,但降低了48和60hpf胚胎Vasa基因的表达水平,可能会对PGCs的迁移过程产生影响。(3)0.0004、0.004、0.04和0.4mg/L的久效磷暴露斑马鱼胚胎至96hpf,采用亚硫酸氢盐测序(BSP)方法检测Vasa基因启动子区5个CpG位点的甲基化状态,采用实时定量PCR检测48、60和96hpf DNA甲基转移酶基因(Dnmt1)以及基化CpG连接蛋白2基因(Mecp2) mRNA的表达水平。结果表明：久效磷暴露斑马鱼胚胎至48、60和96hpf, Vasa基因启动子区的甲基化水平均无显著差异,说明久效磷可能不是通过影响Vasa基因启动子区的甲基化水平来影响其基因表达的。另外,久效磷暴露对Dnmt1基因的表达无影响,却升高了Mecp2基因的表达水平,说明组蛋白的去乙酰化和甲基化可能是久效磷影响Vasa基因表达的潜在机制。综上,本研究表明,久效磷具有胚胎毒性,在个体水平上,能够影响心脏和骨骼的发育,导致心包囊肿和骨骼弯曲;在分子水平上,久效磷能够通过影响心脏发育相关基因Tbx2、肌肉发育基因Mef2c以及性腺发育相关基因Vasa的表达水平,进而影响心脏和性腺发育；并且进一步研究发现,DNA甲基化并不是久效磷影响Vasa基因表达的潜在机制,久效磷可能是通过影响组蛋白的乙酰化和甲基化水平来影响Vasa基因的表达。因此,本文从个体水平和分子水平(包括mRNA水平和DNA水平),探讨了久效磷对斑马鱼胚胎发育的毒性效应及其潜在机制,以期为外源化合物的胚胎毒性研究提供更多的研究思路。
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X592

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本文编号：2754658