黄孢原毛平革菌对四溴双酚A的降解转化及蛋白组学研究

发布时间：2020-08-27 23:56

【摘要】：四溴双酚A(TBBPA)是使用量最大的溴代阻燃剂之一,容易释放到各种环境介质中并造成污染。由于TBBPA具有一定的生物毒性和生物累积性,给生态系统和人类的健康安全带来潜在威胁,因此针对其高效降解技术的研究备受关注。微生物修复是去除环境中有毒有害环境污染物的一种重要手段,其中,白腐真菌因其强大的酶系统在多种有机污染物的降解过程中发挥重要作用。目前关于白腐真菌去除TBBPA的研究主要集中于真菌所分泌的漆酶对TBBPA的降解路径,而非真菌直接生物转化TBBPA的机理,对真菌降解TBBPA的蛋白分子机制的研究甚少。鉴于此,本研究选用黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)作为实验菌株,开展对TBBPA的去除性能、降解途径、解毒特性和蛋白质水平的降解机制研究,此外,还初步考察了P.chrysosporium应用于水/沉积物体系中TBBPA生物强化修复的可行性。本论文取得的主要研究结果如下:(1)P.chrysosporium对TBBPA的去除效果与多种环境因素有关,通过单因素优化实验确定了TBBPA去除的最佳条件为:初始pH 4~5,葡萄糖浓度5 g/L,孢子液接种体积比为5%,TBBPA浓度5 mg/L。在最佳条件下反应3 d后,TBBPA去除率可达97.7%。低浓度(5 mg/L)Cd~(2+)对TBBPA的去除没有显著影响,高浓度(≥20 mg/L)Cd~(2+)则显著抑制P.chrysosporium对TBBPA的去除。外源添加细胞色素P450酶抑制剂可以显著降低TBBPA的去除率,表明菌体细胞色素P450酶参与了TBBPA的降解过程。(2)利用LC-Q-TOF-MS/MS鉴定出7种TBBPA代谢产物,包括:四溴双酚A葡萄糖苷、三溴双酚A、三溴双酚A葡萄糖苷、单羟基四溴双酚A、4-(2-羟基-异丙基)-2,6-二溴苯酚、4-(2-甲氧基-异丙基)-2,6-二溴苯酚以及对羟基苯甲酸。发现除了脱溴途径和氧化裂解途径,真菌还能通过糖苷化和羟基化途径转化TBBPA。为明确P.chrysosporium对TBBPA的解毒特性,以HepG2为模式细胞,考察了不同浓度TBBPA及降解3 d的代谢混合物的细胞毒性效应,结果显示TBBPA(10~50μmol/L)以浓度依赖性方式诱导HepG2细胞中过量ROS的累积,从而引起线粒体损伤并导致线粒体膜电位下降,最后诱发HepG2细胞凋亡。TBBPA代谢混合物对细胞ROS含量、线粒体膜电位以及细胞凋亡的影响较小。TBBPA诱导HepG2细胞阻滞于G0/G1期,处于S期的细胞比例减少。TBBPA代谢混合物对细胞周期的扰乱作用弱于TBBPA。研究表明,TBBPA对HepG2的细胞毒性与细胞周期调控及线粒体途径介导的细胞凋亡有关,P.chrysosporium降解TBBPA后产生的代谢混合物表现出更低的细胞毒性。(3)iTRAQ蛋白质组定量分析结果表明,在P.chrysosporium降解TBBPA的过程中共有148个蛋白发生差异表达,其中90个蛋白表达上调,58个蛋白表达下调。蛋白功能分析结果表明,降解过程中P.chrysosporium细胞内2种细胞色素P450酶、3种谷胱甘肽S-转移酶、2种UDP-葡糖基转移酶、1种O-甲基转移酶和其他氧化还原酶的表达显著上调,它们可能参与了P.chrysosporium转化TBBPA过程中羟基化、还原脱溴、糖苷化、O-甲基化以及其他氧化反应。此外,TBBPA胁迫诱导P.chrysosporium胞内磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、天冬氨酸-tRNA连接酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶4催化亚基的表达上调,用于产生更多的能量并抵抗氧化胁迫。此外参与氨基酸合成和分解代谢途径的多种相关蛋白表达受到抑制。(4)生物强化降解实验结果表明水/沉积物样品中可能存在能降解TBBPA的微生物,未灭菌对照组中TBBPA的降解率为13.91%,生物强化组、生物强化-生物刺激组中TBBPA的降解率分别显著提高至40.19%和78.87%。这两组处理方法均对微生物群落结构产生影响,并导致某些功能菌群得到强化:生物强化使原毛平革菌属成为水/沉积物体系中的优势真菌,优势细菌为黄杆菌属(0.3%~4.4%)和生孢噬纤维菌(1.0%~2.8%)。生物强化-生物刺激处理后,假单胞菌属大量富集(9.6%~17.3%),生孢噬纤维菌属(1.0%~5.5%)的比例也有所增加,推测假单胞菌属可能是TBBPA降解增强的主要原因。此外生孢噬纤维菌属和黄杆菌属也具有潜在的TBBPA降解能力。多种与异生素代谢及微生物细胞自我保护相关的功能基因,如烯酰辅酶A水合酶、3-氧酰基-(酰基载体蛋白)还原酶、谷胱甘肽S-转移酶、甲基接受趋化蛋白和ATP结合盒B亚家族在生物强化-生物刺激组中富集。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X172;X592
【图文】：

路线图,实验技术,路线,四溴双酚

图 1-1 实验技术路线Fig. 1-1 Scheme of methodology1.6.4 创新点（1）本研究对 P. chrysosporium 降解 TBBPA 的代谢产物进行鉴定，发现除了脱溴和 β 断裂，真菌还能够通过糖苷化和羟基化途径转化 TBBPA，相应的转化产物为四溴双酚 A 葡萄糖苷、三溴双酚 A 葡萄糖苷和单羟基四溴双酚 A，为从细胞水平揭示真菌降解和转化 TBBPA 的机理提供了更多理论基础。（2）利用蛋白组学分析方法，考察 P. chrysosporium 降解 TBBPA 和抵御胁迫的关键功能蛋白，从蛋白质水平揭示了 P. chrysosporium 降解 TBBPA 的内在分子机制。

标准曲线,标准曲线

第二章 P. chrysosporium 去除 TBBPA 的性能研究样品的分析和测定上清液，用 1 mol/L 氢氧化钠溶液将 pH 调整为 9，充分摇璃纤维滤膜过滤后，用于高效液相色谱仪定量分析。具体的色谱柱规格为 Kromasil 100-5C18 (AKZONOBEL 250 mm 体积为 20 μL，流速为 0.8 mL/min，柱温为 35℃，柱压约为冰乙酸溶液（含 0.5％乙酸）=85：15（V/V），检测波长为H 为 9 的超纯水配制浓度为 1、2、3、4、5 mg/L 的 TBBPA谱测定峰面积和浓度的标准曲线，拟合结果如图 2-1 所示。

生长曲线,生长曲线

华南理工大学硕士学位论文差异，各组平均值间凡无相同字母的代表具有显著性差异，异不显著。论sporium 生长曲线orium 在葡萄糖液体培养基中的生长曲线如图 2-2 所示。在设了较完整的生长周期。P.chrysosporium 接种至液体培养基后 2 d 后进入对数生长期并通过菌丝体缠绕形成菌丝球，第 5进入衰亡期。处于对数增殖期的菌体活性较强，对底物有较究选用处于对数期的菌体进行实验。

【参考文献】