基于高通量技术的高效秸秆类纤维素降解菌筛选及应用

发布时间：2020-09-02 18:47

　　纤维素类生物质资源是自然界中最丰富的可再生资源之一,纤维素资源的开发利用对于解决当前环境污染、能源危机和粮食短缺等世界性难题具有重要的意义。为进一步增加纤维素生物质的分解效率,获得更多的纤维素降解菌资源,因此,开展了纤维素降解菌筛选的研究。本研究首先建立了高通量纤维素降解菌的筛选方法。基于传统的纤维素降解菌筛选原理,以24孔板和96孔板作为载体减小体系和增加筛选通量,结合刚果红培养基的鉴别作用,以及酶标仪批量采集数据的功能,建立了一套微量、灵敏、快速的高通量筛选方法,并对该方法的培养体系及检测体系进行了优化。结果发现,当24孔深孔板的装液量为2.5mL,培养时间为48h时,微生物的生长效果最好。当酶标仪的检测波长为500nm,96孔板中DNS添加量为120μL时,检测体系的准确性最佳。基于本研究建立的高通量筛选方法,从牛粪中初筛得到9株纤维素降解菌。24孔板发酵复筛后,选取纤维素酶高产菌C-7进一步研究。菌株C-7为革兰氏阳性短杆菌,大小约为1.5~2μm×0.5μm。初步鉴定为Aneurinibacillus sp.strain N8。对其产酶条件进行优化。在初始pH为9,55°C摇瓶培养120h时能够表现出最大的产酶活性,此时CMCase活力和FPase活力分别为1.68U/mL和0.91U/mL。以土壤、牛粪、牛瘤胃液作为筛选源,在厌氧条件下,经长期富集、驯化培养获得具有高效降解纤维素功能的复合菌系H1。该复合菌系5天滤纸纤维素降解率可达89%,在不同培养代数、不同接种量和不同浓度底物培养时均能对滤纸纤维素保持较高的降解量。对玉米秸秆、水稻秸秆的降解率最高可达61.5%和56.4%。H1的发酵的产物主要为丁酸和乙酸,且发酵过程中可以产生一定量的H_2。分别以0.5%的滤纸、玉米秸秆和水稻秸秆为底物发酵7天,乙酸的产量分别为1566mg/L、923 mg/L和740 mg/L左右。丁酸的产量分别为2600mg/L、1323mg/L和986mg/L左右。H_2积累量分别为32ml、9.6mL和5mL左右,约占总产气量的23%、15%和12%左右。在不断富集培养的过程中,复合菌系H1中微生种类和比例组成趋于稳定。对复合菌系进行高通量测序,发现梭菌为主要的优势菌种,主要功能为纤维素的降解及产氢,其次含有一部分杆状菌,主要作用为产酸。
【学位单位】：辽宁大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：X172;X71
【部分图文】：

柱状图,样本群,结构分布,柱状图

2.2.2 高通量测序为了快速确定采集到的样品是否含有纤维素降解菌，将采集到的样品进行了高通量测序，通过分析其中的细菌种群分类和限制性培养的结果相结合，对采集到的样品有个初步的筛选，以便更快的筛选到高效纤维素降解菌株。对测得序列进行生物信息学分析包括进行质量控制，去除前后引物和条形码得到有效序列, 将所有样本序列按照序列间的距离进行聚类，后根据序列之间的相似性将序列分成不同的操作分类单元（OUT）。通常在 97%的相似水平下的 OTU 进行生物信息统计分析。为了得到每个 OTU 对应的物种分类信息,需要对 OTU 进行物种分类，采用两种分类方式：RDP classifier 和 Blast。

物种丰度,样本

样本CNWY物种丰度饼

物种丰度,样本

样本GFZ物种丰度饼

【参考文献】