菜心非特异性脂转移蛋白基因（nsLTP）的克
发布时间：2020-10-09 05:49
农田土壤中邻苯二甲酸酯(Phthalic acid ester,PAEs)的污染状况日趋严重,直接影响农产品质量安全,严重危害人体健康。课题组前期对筛选获得的高/低累积PAEs菜心(Brassica parachinensis L)进行转录组和蛋白组学分析,发现非特异性脂转移蛋白(nsLTP)基因在菜心高、低累积PAEs过程中差异表达十分显著。因此,为探讨nsLTP菜心在高/低累积PAEs差异特性形成中的作用,本研究通过RACE克隆获得了菜心nsLTP基因全长并对其进行序列分析,采用原核表达,亚细胞定位和分子模拟等实验手段研究其分子生理功能,为揭示不同基因型菜心高/低累积PAEs性状形成的分子生物学机制提供基础。本论文取得的主要研究结果如下:(1)本研究以菜心转录组数据为基础,经过RACE克隆获得了菜心nsLTP基因全长。该基因全长587 bp,开放阅读框(ORF)长297 bp。共编码97个氨基酸,蛋白分子量为10.36 KDa,根据蛋白质分子量分类,其属于nsLTP I型蛋白。通过基因序列比对分析发现与油菜(Brasscia nupus)nsTLP基因同源性最高,同源性高达97%,蛋白质多重比对以及进化树分析发现,与芜菁(Brasscia rapa)和油菜(Brasscia napus)差异最小,与芥蓝(Camelina sativa)差异最大。通过对蛋白氨基酸序列进行分析发现,该基因编码的蛋白质N端有一段29个氨基酸大小的信号肽,且具有与信号肽序列重叠的跨膜结构,对应的氨基酸序列疏水性明显。对菜心nsLTP蛋白二级结构和三级结构预测发现,nsLTP基因编码蛋白具有8个半胱氨酸组成4对二硫键而形成的疏水腔空穴。(2)成功构建pET-32a-nsLTP原核表达载体,在IPTG诱导下可在短时间内(3h)获得了大量重组蛋白。该蛋白为可溶性蛋白,低温及提高诱导剂浓度有利于重组蛋白可溶性表达。通过His标签纯化获得了重组蛋白,Western Blot验证显示获得的蛋白为目的重组蛋白。nsLTP基因原核表达及蛋白纯化为进一步研究nsLTP蛋白功能提供了基础。(3)成功构建了亚细胞定位载体pBI-121-GFP-nsLTP,并转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞,侵染洋葱表皮细胞,通过激光共聚焦显微镜观察pBI-121-GFP-nsLTP融合蛋白绿色荧光信号在细胞中的分布情况。结果表明,GFP-nsLTP融合蛋白绿色荧光信号分布在细胞壁上,细胞核、细胞质、细胞膜中均未显示。为进一步确认融合蛋白荧光信号的分布,利用蔗糖溶液将洋葱细胞进行质壁分离,结果发现,原生质体明显皱缩,细胞质和细胞膜中无荧光信号,而细胞壁上发现了明显荧光信号,说明菜心中nsLTP蛋白定位在细胞壁上,与生物信息学预测结果一致。(4)利用分子模拟对DBP和nsLTP蛋白结合模拟分析,结果发现,DBP能紧密结合于nsLTP蛋白的H3和H5 α螺旋形成疏水性口袋中,并与H3 α螺旋上的半胱氨酸(Cys-37)通过氢键结合在一起,形成了 Cys-37:HN:DBP结构,键长为1.784 A。DBP分子被nsLTP蛋白分子中的Cys-65、Leu-36、Asn-64、Pro-63、Pro-34、Ser-62、Ala-61、Lys-33等氨基酯酸残基环绕。由于配体具有可旋转的原子,分子对接中的扭转能(Torsional Energy)为2.98 kcal/mol,配体和蛋白二者相互作用的分子间能量(Inermol Energy)为-7.44 kcal/mol,因此计算得到二者的结合能量(Binding Energy)为-4.46 kcal/mol(结合能=分子间能量+扭转能)。nsLTP蛋白能与DBP结合形成稳定复合物,在菜心吸收累积PAEs过程中具有重要作用。
【学位单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S634.5;X592
【部分图文】：
合邋Ｃ－Ｘｎ－Ｃ－Ｘｎ－ＣＣ－Ｘｎ－ＣＸＣ－Ｘｎ－Ｃ－Ｘｎ－Ｃ邋形成了稳定的空间结构［６３］。逡逑ｎｓＬＴＰ邋Ｉ和ｎｓＬＴＰＩＩ两种类型蛋白内的４对二硫键位置高度保守，但在二硫逡逑键配对的模式有所区别。如图１邋（Ａ）所示，在ｎｓＬＴＰｌ家族中，Ｃｙｓ３与Ｃｙｓ５０逡逑配对，而在１＾！＾？１１中，S8NB８３与迤V８３５配对。此外，由图１（：８）可以看出两种逡逑蛋白的空间结构也有所不同。ｎｓＬＴＰ邋Ｉ蛋白中的－ＣＸＣ－ｍｏｔｉｆ被埋在分子内部，逡逑其中Ｘ通常为亲水性的天冬酰胺（Ａｓｎ）残基；而ｎｓＬＴＰｌＩ蛋白中的－ＣＸＣ－ｍｏｔｉｆ逡逑则暴露在蛋白分子表面，其中Ｘ—般为疏水性的苯丙氨酸（Ｐｈｅ）残基。ｎｓＬＴＰ逡逑Ｉ和ｎｓＬＴＰｌＩ分子中均含有能结合脂质的疏水腔，但二者蛋白的疏水腔凹穴也逡逑有些差别，ｎｓＬＴＰ邋Ｉ蛋白疏水腔空穴较大，而ｎｓＬＴＰ邋ＩＩ蛋白分子中的凹穴比逡逑ｎｓＬＴＰ邋Ｉ的小，但柔性更好，因此，ｎｓＬＴＰＩＩ分子能结合ｎｓＬＴＰ邋Ｉ不能结合的甾逡逑醇等长链分子［６４￣６６］。逡逑６逡逑
２．２结果与分析逡逑２．２．１总ＲＮＡ分析逡逑ＲＮＡ的质量是ＲＡＣＥ全长克隆的成功关键从图２．１可以清晰看到２８Ｓ逡逑ｒＲＮＡ和１８ｓｒＲＮＡ完整，经过微f埡怂嵋羌觳猓希模玻叮埃哄澹希模玻福拔玻保崛〉腻义希遥危链慷冉细撸蔲埥虾茫捎美唇校遥粒茫湃た寺∈笛椋掊义稀觯籗茫慑危玻埃埃板义希保埃埃板义希玻樱渝蜽＾逦１逡逑１００逡逑图２．１菜心总ＲＮＡ逦图２．２邋５，邋ＲＡＣＥ邋产物逡逑Ｆｉｇ邋２．１邋Ｔｈｅ邋ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＬＢ逦Ｆｉｇ邋２．２邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋５’邋ＲＡＣＥ逡逑２．２．２邋ｎｓＬＴＰ基因全长克隆逡逑根据ＬＢ菜心转录组获得的ｎｓＬＴＰ基国片段，设计５’ＲＡＣＥ特异性引物逡逑ＧＳＰ１，与试剂盒自带通用引物（ＵＰＭ）进行ＰＣＲ扩增，克隆得到４６０ｂｐ的单逡逑一条带（图２．２）。将５’ＲＡＣＥ全长克隆产物测序结果与ＬＢ高通量测序序列拼逡逑接，去除重复序列得到目的基因ｃＤＮＡ序列，获得菜心ｎｓＬＴＰ基因全长序列共逡逑５８７ｂｐ，并上传至ＮＣＢＩ邋（登录号ＭＨ１２７９１６）。植物的ｎｓＬＴＰ墓：因从１９７５年被逡逑发现并命名至今
逡逑２．２．３逦ｎｓＬＴＰ基因序列分析逡逑经分析菜心ｎｓＬＴＰ基因编码蛋白区域长２９４ｂｐ邋（图２＿３），共编码９７个氨逡逑基酸，分子f堅嘉
本文编号：2833307
【学位单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S634.5;X592
【部分图文】：
合邋Ｃ－Ｘｎ－Ｃ－Ｘｎ－ＣＣ－Ｘｎ－ＣＸＣ－Ｘｎ－Ｃ－Ｘｎ－Ｃ邋形成了稳定的空间结构［６３］。逡逑ｎｓＬＴＰ邋Ｉ和ｎｓＬＴＰＩＩ两种类型蛋白内的４对二硫键位置高度保守，但在二硫逡逑键配对的模式有所区别。如图１邋（Ａ）所示，在ｎｓＬＴＰｌ家族中，Ｃｙｓ３与Ｃｙｓ５０逡逑配对，而在１＾！＾？１１中，S8NB８３与迤V８３５配对。此外，由图１（：８）可以看出两种逡逑蛋白的空间结构也有所不同。ｎｓＬＴＰ邋Ｉ蛋白中的－ＣＸＣ－ｍｏｔｉｆ被埋在分子内部，逡逑其中Ｘ通常为亲水性的天冬酰胺（Ａｓｎ）残基；而ｎｓＬＴＰｌＩ蛋白中的－ＣＸＣ－ｍｏｔｉｆ逡逑则暴露在蛋白分子表面，其中Ｘ—般为疏水性的苯丙氨酸（Ｐｈｅ）残基。ｎｓＬＴＰ逡逑Ｉ和ｎｓＬＴＰｌＩ分子中均含有能结合脂质的疏水腔，但二者蛋白的疏水腔凹穴也逡逑有些差别，ｎｓＬＴＰ邋Ｉ蛋白疏水腔空穴较大，而ｎｓＬＴＰ邋ＩＩ蛋白分子中的凹穴比逡逑ｎｓＬＴＰ邋Ｉ的小，但柔性更好，因此，ｎｓＬＴＰＩＩ分子能结合ｎｓＬＴＰ邋Ｉ不能结合的甾逡逑醇等长链分子［６４￣６６］。逡逑６逡逑
２．２结果与分析逡逑２．２．１总ＲＮＡ分析逡逑ＲＮＡ的质量是ＲＡＣＥ全长克隆的成功关键从图２．１可以清晰看到２８Ｓ逡逑ｒＲＮＡ和１８ｓｒＲＮＡ完整，经过微f埡怂嵋羌觳猓希模玻叮埃哄澹希模玻福拔玻保崛〉腻义希遥危链慷冉细撸蔲埥虾茫捎美唇校遥粒茫湃た寺∈笛椋掊义稀觯籗茫慑危玻埃埃板义希保埃埃板义希玻樱渝蜽＾逦１逡逑１００逡逑图２．１菜心总ＲＮＡ逦图２．２邋５，邋ＲＡＣＥ邋产物逡逑Ｆｉｇ邋２．１邋Ｔｈｅ邋ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＬＢ逦Ｆｉｇ邋２．２邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋５’邋ＲＡＣＥ逡逑２．２．２邋ｎｓＬＴＰ基因全长克隆逡逑根据ＬＢ菜心转录组获得的ｎｓＬＴＰ基国片段，设计５’ＲＡＣＥ特异性引物逡逑ＧＳＰ１，与试剂盒自带通用引物（ＵＰＭ）进行ＰＣＲ扩增，克隆得到４６０ｂｐ的单逡逑一条带（图２．２）。将５’ＲＡＣＥ全长克隆产物测序结果与ＬＢ高通量测序序列拼逡逑接，去除重复序列得到目的基因ｃＤＮＡ序列，获得菜心ｎｓＬＴＰ基因全长序列共逡逑５８７ｂｐ，并上传至ＮＣＢＩ邋（登录号ＭＨ１２７９１６）。植物的ｎｓＬＴＰ墓：因从１９７５年被逡逑发现并命名至今
逡逑２．２．３逦ｎｓＬＴＰ基因序列分析逡逑经分析菜心ｎｓＬＴＰ基因编码蛋白区域长２９４ｂｐ邋（图２＿３），共编码９７个氨逡逑基酸，分子f堅嘉
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