猪场废水中四环素类抗生素对斑马鱼抗氧化效应毒理研究

发布时间：2020-10-19 17:58

　　 四环素类抗生素(TCs)作为一种广谱抗菌药,被广泛应用于兽药和饲料添加剂中。随着畜禽养殖业的规模化和集约化发展,兽用抗生素滥用现象越来越严重。进入动物体内的抗生素约80~90%以原药或其代谢产物的形式排出体外,然而,我国尚无较完善的针对抗生素的处理技术体系及相关排放要求,残留在各种养殖废水中的抗生素最终进入水环境中?目前,关于TCs对水生生物氧化损伤的研究已有很多,但对其影响水生生物抗氧化能力的潜在分子机制知之甚少。本研究采用超高效液相色谱-质谱联用仪(UPLC-MS/MS)对赣江流域周边3个规模化生猪养殖场废水处理工艺中部分构筑物出水及排放口下游水体中代表性TCs(包括金霉素、土霉素和四环素)的残留特征进行分析。进一步地,以斑马鱼为水生模式生物,研究它们在斑马鱼幼鱼体内的富集与代谢特征。最后,考察这三种抗生素对斑马鱼幼鱼抗氧化系统的影响并采用分子计算毒理学技术研究TCs和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)间的相互作用,以初步探索TCs造成鱼体氧化损伤的作用机理。主要研究成果如下:(1)在3个规模化养猪场的水样中均检出了金霉素、土霉素和四环素。各猪场所配备的常规厌氧-好氧组合工艺对畜禽养殖废水中TCs的处理效率均高于89%,但工艺出水中TCs的残留浓度仍处于μg/L水平,且在排放口附近水体中的浓度较为稳定。证实畜禽养殖场附近存在较大抗生素污染负荷。(2)经2 mg/L金霉素、5 mg/L土霉素和2 mg/L四环素暴露48 h后,斑马鱼幼鱼体内的抗生素含量分别为0.53 mg/kg、0.29 mg/kg和0.19 mg/kg(湿重),相应的BCF_(48h)值分别为0.3206、0.0621和0.1152,说明这三种抗生素生物富集能力很弱。在清水暴露阶段,它们的消除速率常数分别为0.022 h~(-1)、0.012 h~(-1)、0.014 h~(-1),相应的半衰期分别为31.51 h、57.76 h、49.51 h,说明金霉素、土霉素和四环素在生物体内的代谢较快。(3)金霉素、土霉素和四环素均能导致斑马鱼幼鱼产生氧化应激,且大小关系表现为:金霉素四环素土霉素。在金霉素暴露条件下,SOD、CuZn-SOD、CAT、GP_X活性均降低,GSH和MDA含量升高,SOD、CAT、Nrf2基因表达量下降,SOD、CAT、Nrf2蛋白质表达水平下调;在土霉素暴露条件下,CAT、GST活性均被抑制,GP_X活性升高,MDA含量显著降低,SOD、CAT、Nrf2基因表达量整体下降,SOD、CAT、Nrf2蛋白质表达水平呈浓度依赖性下调;在四环素暴露条件下,SOD、CuZn-SOD、CAT、GP_X、GST活性均被诱导,GSH含量升高,SOD、CAT、Nrf2基因表达量提高。随着暴露浓度的升高,SOD、CAT蛋白表达由诱导状态转为被抑制状态,Nrf2蛋白质表达水平则呈浓度依赖性下调。分子对接与动力学模拟结果显示三种抗生素均能通过氢键与zfPI3K紧密结合,并且zfPI3K蛋白激酶中的GLN636是对结合自由能起着最主要贡献的氨基酸残基。由此推测金霉素、土霉素和四环素可能是潜在的PI3K抑制剂,能够抑制Nrf2介导的抗氧化应激调控,从而降低斑马鱼幼鱼的抗氧化能力。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：X171.5;X713
【部分图文】：

的出水口以及排放口下游 100 m 处（在液面下 20 cm 采样）进行布点点位采 3 个平行样，样品用 1000 mL 聚乙烯塑料瓶封口，用锡箔纸包冰袋保存带回实验室，于-20 ℃储存并尽快进行预处理和检测。.2 斑马鱼幼鱼的获取野生型 AB 系斑马鱼饲养于斑马鱼循环养殖系统（Tecniplast，意大利，图 2.1 所示）中。水质条件为：水温 27±1 ℃、pH 值 7.5±0.3、电导率 5光暗周期比为 14 h /10 h（昼/夜），每天喂食 2 次干饲料（Skretting Nu）。选用健康状况良好的成年斑马鱼用于产卵，产卵前一天晚上将 3 4 条雄鱼放入 1.7 L 交配盒（Tecniplast，意大利）中，雌雄鱼用透明隔次日早上（约 08：00）抽开隔板，在灯光刺激下雌雄交配产卵。收集 3的鱼卵，用系统水清洗胚胎，在体视显微镜下挑选受精正常的胚胎置光照培养箱（RXZ 型，宁波江南仪器厂）中，温度控制在 27±1 ℃。选正常发育 72 hpf（hours post-fertilization，hpf）的胚胎（已孵化成幼接下来的暴露实验

USA）；柱温：35℃；流速：0.30 mL/min；进样量：10 μL；金的流动相：A 为 0.2%甲酸水溶液，B 为纯乙腈；二者洗脱梯度：0～040% B；0.5～2.0 min，40%～70% B；四环素的流动相：A 为 10 m 为纯甲醇；洗脱梯度：0~3.0 min，55% B~55% B。谱条件：电喷雾源（ESI），多反应监测方式（MRM），正离子模度：300 ℃；干燥气流量：3.0 L/min；雾化气压力：15.0 psi；毛2 V；碰撞气体为氩气，碰撞室气压为 1.30×10-5Pa。其他参数见表表 2.3 质谱参数Tab.2.3 Mass spectrum parameters合物 母离子（m/z） 子离子（m/z） 裂解电压/V 碰撞能霉素 478.9 461.9 100 1霉素 461 425.9 100 2环素 445 409.9 125 1

第 5 章 TCs 对斑马鱼幼鱼抗氧化系统的影响CAT 蛋白的表达量虽然不多，但其活性均完全表达出来，因此出表达变化趋势不匹配的现象。i 等[158]证实 PI3K/Akt 通路是 Nrf2 信号的上游激活因子。有研究表 蛋白激酶的磷酸化作用会促进细胞质中 Nrf2 的解离。先前已有文献/Akt 信号通路控制 Nrf2/ARE 信号通路的激活，且 PI3K 蛋白激酶的制 Nrf2 活化[159]。因此，推测这三种抗生素可能通过与 PI3K 相互3K 蛋白激酶的抑制剂，从而导致 Nrf2 蛋白表达的下降以及受 Nrf2/调控的 CAT 和 SOD 蛋白表达的下降。
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本文编号：2847531