负载β-内酰胺酶磁性纳米粒的制备及降解青霉素G的研究

发布时间：2020-10-28 03:10

　　 由于β-内酰胺类抗生素在医疗、农业及畜牧业等领域的广泛使用,其环境残留对生态安全产生了严重威胁。目前,传统的污水处理技术难以完全、高效、经济地处理该类抗生素在水体中的残留,因此,本文将β-内酰胺酶负载于磁性纳米粒表面,用于高效特异性降解废水中的青霉素G,并对影响该过程的因素进行了研究,为其进一步应用奠定了实验基础。主要工作包括:设计并优化了共价固定酶过程,并对固定酶与游离酶的酶学性能进行了比较研究,发现固定化酶对反应环境的敏感度、热稳定性及储存稳定性均有一定的改善。在β-内酰胺类抗生素代表性药物——青霉素G水溶液中,50 mg的固定化酶磁性纳米粒能在5 min内完全降解浓度为5-50 mg/L的青霉素G水溶液100 mL,并且在重复使用35次后仍保留近95%的降解效率,说明该固定化方法能够使β-内酰胺酶重复利用,降低了其在抗生素降解应用中的经济成本。将交联后的β-内酰胺酶固定于磁性纳米粒,通过与直接固定化方法的对比,发现交联后固定能够更有效地保留该酶活(90.7±3.1%),并且其稳定性及对反应条件的敏感度有显著改善,该方法得到的固定化酶在室温下储存20天仍保留50%的酶活力。另外,利用发酵液作为青霉素生产的模拟废液,系统探究了交联后固定酶的重复使用效果。结果显示,交联后固定化酶磁性纳米粒在使用量为0.5 mg/mL时,5 min能够完全降解5 mg/L的青霉素G发酵废液100 mL,并且在重复使用40次后依然维持98%的降解效率。以上实验结果表明,使用交联后固定化法制备的负载β-内酰胺酶磁性纳米粒可以作为一种经济、高效、操作简便的方法,在工业废水中β-内酰胺类抗生素残留的降解应用中具有良好的前景。
【学位单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：X703;TB383.1
【部分图文】：

天津大学硕士学位论文白质。其蛋白三维结构如图 1-1 所示，蛋白结构主要分为两个区域，包括 8 螺旋组成的全 α 区域，以及 3 个 α 螺旋和 5 个 β 折叠组成的 α/β 区域。其中于 164 位的天冬氨酸残基与位于 179 位的精氨酸残基形成了一个盐桥以维性识别中心Ω环的稳定，并且蛋白仅含一对二硫键维持构象的稳定(77位与1的半胱氨酸残基)。

图 1-2 TEM 型 β-内酰胺酶的活性位点示意图[35]Figure 1-2 Schematic of active site of TEM β-lactamase1.3 酶固定化概述固定化酶指的是利用物理或者化学的方法，将蛋白酶限制于一定的空间内并保留其催化活性。该方法能够使蛋白酶便于从反应体系中分离，从而控制酶促反应进程。与游离酶相比较，固定化酶对于操作条件的敏感度较低，一般表现出较高的热稳定性与储存稳定性，并且能够从反应体系中分离回收、重复利用，极大的降低了酶促反应的经济成本。总的来说，固定化酶技术提高了催化酶的生产力，改善了蛋白酶的催化效果，使得酶催化技术能够应用于更广泛的领域。1.3.1 固定化酶方法

图 1-3 固定化酶方法：(A)物理吸附法，(B)包埋法；(C)共价固定与交联法[36]Figure 1-3 Enzymatic immobilization methods：(A) physical adsorption, (B) entrapment, (C)covalent attachment and crosslinking1.3.1.1 物理吸附法蛋白酶可以通过物理作用(如疏水作用、范德华力、氢键及静电作用等)可逆地固定于载体表面的方法称之为物理吸附法。其具有操作简单、成本低、酶活保留率较高等优势。该方法得到的固定化酶与载体的结合力较弱，可以在温和的条件下从载体上可逆移除，从而使载体再生，有效降低载体的使用成本。Atacan[37]等人通过静电作用将胰蛋白酶吸附固定于磁性纳米粒表面，该固定化酶具有较高的酶活保留率 (92%)，并且相比于游离酶表现出良好的储存稳定性。然而，物理吸附过程通常需要将载体浸入酶溶液中孵育一段时间，或者将酶溶液置于载体表面晾干，然后冲洗掉未被吸附的酶。由于物理作用的结合能力较弱，在固定化酶
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本文编号：2859490