厚壳贻贝（Mytilus coruscus）对大田软海绵酸类毒素的蓄积和消除规律研究

发布时间：2020-10-31 21:38

　　 大田软海绵酸(Okadaic Acid,OA)及其衍生物鳍藻毒素(Dinophysistoxins,DTXs)是腹泻性贝毒(Diarrhetic shellfish poisons,DSP)中分布最广、危害最大的一类组分。研究显示,OA类毒素除急性毒性(腹泻、呕吐等)外,还存在多种慢性毒性作用。本文在OA类毒素在致毒机制、体内实验、细胞毒性、遗传毒性、神经毒性、免疫毒性等方面进行了综述,为OA类毒素的进一步毒理学研究提供了参考。本文对本实验前期所建立的OA类毒素的提取方法进行了验证。结果显示,色谱图目标峰对称尖锐,附近无杂峰;OA类毒素在0.5-20 ng/mL内线性良好,相关系数均大于0.999,该方法回收率高,精密度和灵敏度均满足后续实验样品中OA类毒素的检测需求。以厚壳贻贝为研究对象,基于前期建立的免疫亲和前处理净化手段和液质联用检测法,通过室内模拟暴露实验,研究了不同暴露时间下OA类毒素在贻贝及其组织中的蓄积和消除规律:(1)短期室内模拟暴露实验下,设置单只贻贝P.lima的日饲喂水平为5×10~4cell,P.lima仅产生OA和DTX-1,其单细胞毒力分别为2.62±0.01、2.31±0.01 pg;贻贝体内只含有OA和DTX-1,贻贝对P.lima的滤食率由99.1%逐渐下降至96.1%;贻贝对OA和DTX-1的转化率分别为48.3-59.3%和48.5-61.4%;OA类毒素蓄积的靶器官是消化腺,各组织对OA类毒素蓄积能力的强弱关系为消化腺鳃肌肉外套膜咬合肌,毒素消除能力的强弱关系为鳃消化腺外套膜咬合肌肌肉;在当前投喂水平下,仅需10天贻贝体内毒素含量将高于45 OA eq./g。贻贝对OA类毒素的平均蓄积和消除速率分别为5.0和1.8 ng OA eq./g/day,贻贝对OA和DTX-1的半衰期均为4.2天。(2)长期室内模拟暴露实验下,设置单只贻贝P.lima的日饲喂水平为5×10~5cell,P.lima仅产生OA和DTX-1,其单细胞毒力分别为3.94±0.01和3.44±0.01 pg;贻贝体内含有OA、DTX-1和DTX-3,DTX-3所占比例为3.3-17.9%,OA和DTX-1是毒素存在的主要形式;贻贝对P.lima的滤食率由99.4%降低至58.5%;贻贝对OA和DTX-1的转化率分别为59.0-89.9%和49.9-94.9%;OA类毒素蓄积的靶器官是消化腺,各组织对OA类毒素蓄积能力的强弱关系为消化腺鳃肌肉外套膜咬合肌,毒素消除能力的强弱关系为鳃咬合肌肌肉消化腺外套膜;蓄积第3天,OA类毒素的含量即已超过安全限量值160 ng OA eq./g,蓄积第7天时,其含量达到324.5 ng OA eq./g,两倍于现行安全限量;贻贝对OA和DTX-1的半衰期分别为27.1和20.3天。若以欧盟所建议的45 ng OA eq./g为DSTs的安全限量,则推算需要42.8天才能使贻贝体内OA类毒素含量低于这一值。(3)对比短期和长期室内模拟暴露实验,可以发现:P.lima均只产生OA和DTX-1,然而,其产毒水平并非持续不变;P.lima饲喂水平和饲喂天数不仅影响贻贝的滤食率,还对贻贝对OA和DTX-1的转化率产生影响;消化腺始终保持最快的毒素蓄积速率和最大的毒素蓄积量;贻贝各组织对毒素的蓄积能力相同,但对毒素的消除能力产生差异;单只贻贝的日饲喂水平为5×10~4cell不足以使贻贝超过安全限量,而若将饲喂水平升至原来的10倍,仅需3天,贻贝体内毒素含量就已经超过安全限量。
【学位单位】：浙江海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：X55;S944
【部分图文】：

图 1-1 OA 类毒素化学结构式Fig.1-1 Chemical structures of OA related toxins.1 中毒事件因食用 OA 类毒素污染的贝类产品，引发了 2006 年英国伦敦 159 人、201建福鼎 48 人中毒事件、2011 年浙江宁波和福建宁德 200 人等中毒事件[24]，者中毒后出现腹泻（92%）、恶心（80%）、呕吐（79%）、腹痛（53%）（10%）等症状[25]。OA 类毒素属于非致死性毒素，患者在治疗 2-3 天后即复。.2 作用机理蛋白质磷酸化是由蛋白质激酶催化的把 ATP 磷酸基转移到底物蛋白质氨基基上的过程，主要通过丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（protein phosphatases，PPsP1、2A、3、4、5）、酪氨酸 PPs 及双功能 PPs（TMDP、VHR、DUSP2调控完成[26-28]。研究显示，OA 类毒素可作为 PP1、PP2A 和 PP5 的烈性抑

15图 2-2 阳性贻贝样品（A）和加标水平为 5.0 ng/g 贻贝样品（B）MRMg.2-2 MRM chromatograms of positive mussel sample（A）and musssel spiked a（B）图 2-2 可知，OA 和 DTX-1 在阳性贻贝样品和加标贻贝样品中的出致；阳性贻贝样品中无 DTX-2 出峰，说明阳性样品中不含有 DTX

图 3-1 P. lima 生长曲线及平台期产毒能力Fig.3-1 Growth curve of P. lima and its toxin level in plateau period3.4.2 贻贝对 OA 类毒素的蓄积、消除室内模拟暴露实验期间，实验组和空白组贻贝均生长状态良好，无死亡现象。观察各实验组贻贝的滤食情况，仅在海水中观察到微量 P.lima 的存在，贻贝对P.lima 的滤食率在 3 天内自 99.1%逐渐下降为 96.1%。液质联用检测显示贻贝体内毒素组成与有毒饵料藻一致，只含有 OA 和 DTX-1 两种毒素。文献报道，OA类毒素在海洋贝类中的存在形态包括游离态和酯化态，贻贝的毒素酯化率远低于其他贝类[84]。本实验通过在碱性条件下水解释放出酯化态 OA 类毒素，对其总量进行检测，发现酯化态毒素所占比例为 5.2-12.2%，自由态是主要的毒素形式。贻贝对 OA 和 DTX-1 的转化率分别为 48.3-59.3%和 48.5-61.4%。蓄积期内 OA 类毒素在各组织的分布比例如图 3-2 所示。消化腺是 OA 类毒素蓄积的靶组织，高达 59.0-69.6%的毒素集中在该组织；随着蓄积天数的增加，鳃中的毒力水平明显上升，是仅次于消化腺的毒素蓄积组织（22.5-26.6%）；肌
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本文编号：2864544