磁性交联漆酶聚集体的制备及其在染料降解中的应用
发布时间：2020-11-03 21:57
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,其催化效率高,作用底物范围广,在工业中具有广阔应用前景。本课题利用实验室获得的重组解淀粉芽孢杆菌漆酶为基础,通过交联酶聚集体(CLEAs)来进行漆酶的固定。对其中影响酶活性的相关因素进行了优化,对游离酶和磁性交联漆酶聚集体(magnetic cross-linked enzyme aggregates,M-CLEAs)酶学性质进行了分析,对漆酶M-CLEAs在染料降解方面进行应用,结果如下:优化后的固定条件为:以饱和硫酸铵为沉淀剂,硫酸铵和漆酶体积比为3:1,沉淀温度25℃,沉淀3 h后,使用0.16%戊二醛,交联1 h,加入的磁性纳米粒子与漆酶最优质量比为7:1,在此制备条件下,最终酶活回收率为37%。与游离酶相比,漆酶M-CLEAs适应的pH值范围更广,在pH值8.6下相对酶活仍保留50%,而游离酶相对酶活只有25%;在不同体积分数的有机溶剂下,漆酶M-CLEAs的稳定性更好,30%浓度甲醇下漆酶M-CLEAs的酶活是游离酶的1.5倍,在添加较高浓度30%乙醇、丙酮条件下,漆酶M-CLEAs的酶活也均优于游离漆酶;在添加不同浓度NaCl后,漆酶M-CLEAs表现出更好地耐盐性,在高浓度1 M NaCl下,漆酶M-CLEAs保留70%的酶活,而游离漆酶只保留20%酶活。漆酶M-CLEAs在无介体存在时对不同结构的染料脱色效果较差,介体乙酰丁香酮的添加促进了酶与染料的氧化反应,6 h内对靛红可以完全脱色,活性黑5的脱色率达到90%以上,对RB亮蓝也有64%的脱色率;随着活性黑5和靛红染料浓度分别提高到160 mg/L和100 mg/L,在6 h后也同样完全脱色;在重复降解靛红实验中,反复使用七次,仍有接近30%脱色率,为固定化漆酶应用于染料废水的处理奠定了基础。
【学位单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：X703;Q814.9
【部分图文】：
通过添加交联剂使酶分子之间发生交联进行固定。无载体固定大概分为四种类??型：由溶解酶直接交联产生（ＣＬＥ）、结晶酶（ＣＬＥＣ）、喷雾干燥酶（ＣＬＳＤ）和聚合酶??（ＣＬＥＡ）。制备流程如图１－１所示：??Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ?ｅｎｚｙｍｅ??？?Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｒ??＿?＿??？＾／ＡＧＧ?＾＼＾ＳＤＥ?＼??＃?＃?＃?＾??ＣＬＥＣ?ＣＬＥＡ?ＣＳＤＥ?ＣＬＥ??图１－１无载体固定化酶制备流程图??（ａ）结晶；（ｂ）聚集；（ｃ）喷雾干燥；（ｄ）直接交联【１１］??Ｆｉｇ．?１－１?Ｐｒｏｃｅｓｓ?ｏｆ?ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ?ｅｎｚｙｍｅ?ｗｉｔｈｏｕｔ?ｃａｒｒｉｅｒ??（ａ）?ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ；?（ｂ）?ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ；?（ｃ）?ｓｐｒａｙ－ｄｒｙｉｎｇ；?（ｄ）?ｄｉｒｅｃｔ?ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇ??交联溶解酶（ＣＬＥｓ）：在２０世纪６０年代，研究人员发现使用双功能交联试剂，如戊??二醛，可以将化学基团连接起来，获得不溶性蛋白的，使其不再溶解，保留了酶的活??性，这种方法即为交联溶解酶（ＣＬＥｓ）［１２，１３］。虽然ＣＬＥｓ可以提高酶的热稳定性，但是其??重复稳定性较差
２．３．１．２沉淀剂与漆酶比例对酶活的的影响??通过对沉淀剂与漆酶体积比例的优化，考察了?１：１、３：１、５：１、７：１条件下的结果，??如图２－２所示。选择硫酸铵为沉淀剂，２５°Ｃ下，在沉淀剂与漆酶体积比为３：１时，酶活??回收率最高，为７４．５％，由于沉淀剂体积的增加，增大了蛋白分子的沉淀量，酶活回收??率增加。但随着沉淀剂体积的增加，酶活回收率逐渐下降，这可能是由于过量的沉淀剂??剥夺了酶蛋白分子内部的水分，导致酶活回收率降低，在沉淀剂与漆酶比例为７：１时，??酶活回收率下降至５６％。可见，沉淀剂的体积多少也会引发酶不同程度的聚集，如果沉??淀剂体积过高会造成酶的活性丧失，如果沉淀剂体积太低，酶沉淀将不充分，导致酶活??回收率较低，因此，在沉淀剂与漆酶体积比为３：１时为最佳的实验条件。??－１１－??
Ｆｉｇ．２－２?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ?ｔｏ?ｌａｃｃａｓｅ?ｒａｔｉｏ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ?ｐｒｏｃｅｓｓ??２．３．１．３沉淀温度对酶活的影响??通过优化沉淀过程中温度的考察，结果如图２－３所示。使用硫酸铵作为沉淀剂，沉??淀剂与漆酶比例为３：１条件下，恒温震荡３?ｈ，随着温度的增高，酶活回收率逐渐升??高，在２５°Ｃ下，酶活回收率最高为８９％，随着温度的升高，在２５°Ｃ以后，酶活回收率??又逐渐下降，在３０°Ｃ时，酶活回收率下降到８４％，这可能由于温度过高，破坏了酶内??部的结构，酶分子间共价键断裂，导致沉淀效果下降，而温度过低时，酶的沉淀不完??全，酶活回收率较低，因此２５°Ｃ下，酶的沉淀效果最好。??１００?ｒ??９５?－??９０?－?Ｔ?丄??？?８５?－?「＂］内?ｔ?土??赚?１??老８０?－??回?ｒＨ??Ｋ?７５?－?＾?一??鏜??７０?＿??６５?－??６０?￣——￣１￣￣——￣１￣——￣１￣——￣１￣——￣１￣——￣＇??０?１０?１５?２０?２５?３０??温度（Ｃ）??图２－３温度对沉淀过程的影响??Ｆｉｇ．２－３?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｔｅｍｐｅｒｔｕｒｅ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ?ｐｒｏｃｅｓｓ??－１２－??
【参考文献】
本文编号：2869157
【学位单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：X703;Q814.9
【部分图文】：
通过添加交联剂使酶分子之间发生交联进行固定。无载体固定大概分为四种类??型：由溶解酶直接交联产生（ＣＬＥ）、结晶酶（ＣＬＥＣ）、喷雾干燥酶（ＣＬＳＤ）和聚合酶??（ＣＬＥＡ）。制备流程如图１－１所示：??Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ?ｅｎｚｙｍｅ??？?Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｒ??＿?＿??？＾／ＡＧＧ?＾＼＾ＳＤＥ?＼??＃?＃?＃?＾??ＣＬＥＣ?ＣＬＥＡ?ＣＳＤＥ?ＣＬＥ??图１－１无载体固定化酶制备流程图??（ａ）结晶；（ｂ）聚集；（ｃ）喷雾干燥；（ｄ）直接交联【１１］??Ｆｉｇ．?１－１?Ｐｒｏｃｅｓｓ?ｏｆ?ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ?ｅｎｚｙｍｅ?ｗｉｔｈｏｕｔ?ｃａｒｒｉｅｒ??（ａ）?ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ；?（ｂ）?ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ；?（ｃ）?ｓｐｒａｙ－ｄｒｙｉｎｇ；?（ｄ）?ｄｉｒｅｃｔ?ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇ??交联溶解酶（ＣＬＥｓ）：在２０世纪６０年代，研究人员发现使用双功能交联试剂，如戊??二醛，可以将化学基团连接起来，获得不溶性蛋白的，使其不再溶解，保留了酶的活??性，这种方法即为交联溶解酶（ＣＬＥｓ）［１２，１３］。虽然ＣＬＥｓ可以提高酶的热稳定性，但是其??重复稳定性较差
２．３．１．２沉淀剂与漆酶比例对酶活的的影响??通过对沉淀剂与漆酶体积比例的优化，考察了?１：１、３：１、５：１、７：１条件下的结果，??如图２－２所示。选择硫酸铵为沉淀剂，２５°Ｃ下，在沉淀剂与漆酶体积比为３：１时，酶活??回收率最高，为７４．５％，由于沉淀剂体积的增加，增大了蛋白分子的沉淀量，酶活回收??率增加。但随着沉淀剂体积的增加，酶活回收率逐渐下降，这可能是由于过量的沉淀剂??剥夺了酶蛋白分子内部的水分，导致酶活回收率降低，在沉淀剂与漆酶比例为７：１时，??酶活回收率下降至５６％。可见，沉淀剂的体积多少也会引发酶不同程度的聚集，如果沉??淀剂体积过高会造成酶的活性丧失，如果沉淀剂体积太低，酶沉淀将不充分，导致酶活??回收率较低，因此，在沉淀剂与漆酶体积比为３：１时为最佳的实验条件。??－１１－??
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【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 谭天伟;陈必强;;脂肪酶及其在化学品合成中的应用[J];生物产业技术;2010年04期
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1 郑德兵;磁性纳米交联酶聚集体的制备及其在微管式反应器中的应用[D];北京化工大学;2017年
2 杨晓丹;一色齿毛菌（cerrena unicolor）漆酶的固定化及在环境污染物降解中的应用研究[D];福州大学;2016年
3 崔立立;磁性杂体交联酶聚集体的制备及酶学特性的研究[D];河北科技大学;2014年
本文编号：2869157
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