植物根表铜离子流检测体系的建立与应用

发布时间：2020-11-16 13:09

　　 近年来,研究者们在植物重金属吸收方面开展了广泛而深入的研究工作,并已取得了相当的进展,但对于重金属离子的跨膜转运途径及机制仍需要进一步的探究。在生理条件下测量植物根的重金属离子流对于理解植物的重金属吸收转运机制具有重要的意义。基于离子选择性微电极的非损伤微测技术(Non-invasive Micro-test Technology,NMT)以其非损伤性、高时空分辨率等特点,为我们解决上述问题提供了新的途径。该技术已成功应用于植物的Cd2+流速检测,但在其他重金属离子流的检测方面尚缺乏研究和应用。铜既是植物必需的微量营养元素,又是污染环境的重金属元素,建立可靠的植物铜离子流检测技术对研究Cu2+的跨膜转运机制具有积极的应用价值。本论文筛选出了性能良好的Cu LIX,通过能斯特斜率、检测限、选择性系数等参数考察了 Cu2+选择性微电极的性能;利用人工离子源试验分析了 Cu2+选择性微电极检测Cu2+流速的可靠性与稳定性,从而建立了适用于植物Cu2+流检测的非损伤微测系统;考察了常用的植物营养生理试剂对Cu2+流速检测的影响;在此基础上,应用该技术比较了水稻、玉米和白羽扇豆根尖不同位置的Cu2+流速和Cu2+流速随介质Cu2+供给水平变化的动力学特征;考察了 K+、Ca2+、Na3VO4、EDTA对白羽扇豆和水稻根Cu2+吸收的影响以及硅对水稻根Cu2+吸收的影响,进而分析了植物的Cu2+吸收特征和机理。通过研究,得到了以下结果:1、离子载体N,N,N',N'-四环已基-2,2'-硫代二乙酰胺含量为0.36~0.72%的Cu LIX对Cu2+表现出了良好的响应,能斯特斜率为29.15±0.63~29.22±0.76mV/decade,接近理论值28.5mV/decade;检测限低于1 μMCu2+;对干扰离子 Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cd2+、Pb2+、K+、Na+、NH4+的选择性,logK 分别为-2.92~-3.03、-3.23~-3.57、-2.44~-2.58、-1.95～-2.23、-0.56~-1.38、-4.76~-7.28、-4.95~-6.78、-5.25~-7.18;在测试液 pH 4~7 的范围内,含量为0.36%的Cu LIX有着更稳定的表现。2、在距人工离子源不同距离处,Cu2+流速的测定值与预测值接近,且流速稳定后在lOmin内测定值变化幅度很小。可见,基于Cu2+选择性微电极的NMT技术可以准确地测定样品表面的Cu2+流信息并可在一定时间内保持稳定的测量值。3、在应用NMT检测Cu2+流速时,植物营养生理试验中常用的药剂对检测结果有不同程度的影响。50μM TEA、50μMNa3VO4、200μMLaCl3、200μM GdC13、200μMEDTA、200μM NEM对Cu2+流速的测定无明显影响,而200μM柠檬酸会显著增加微电极的电势测定值。4、植物根尖(距根顶端1000μm范围内)的Cu2+扫点试验表明,距离根顶端不同位置处的Cu2+流速变化特征因植物种类而不同。白羽扇豆和水稻的Cu2+流速最大值分别出现在距根顶端0～50μm和100~200μm处,而后流速随距离增加而逐渐降低;玉米在距根顶端1OOOμm范围内保持着较高的Cu2+内流流速。5、在5~200μM的Cu2+浓度范围内,植物根尖的Cu2+流速随Cu2+浓度的增加而升高,变化趋势基本符合Michaelis-Menten方程的描述。白羽扇豆的Vmax为199.39 土25.43pmol/cm2/s,高于扬稻6号的 155.49±12.74pmol/cm2/s与日本晴的 125.67±7.39pTmol/cm2/s;而 Km 值为 84.33±12.49μM,高于扬稻 6 号的 73.49±8.21μM 与日本晴的79.83±5.17μM。综合来看,白羽扇豆根的Cu2+吸收能力高于两个品种的水稻。6、在50μM Cu2+浓度下,10 mM K+、5 mM Ca2+均对白羽扇豆、水稻根的Cu2+吸收有显著抑制作用;50μMNa3VO4显著抑制白羽扇豆根的Cu2+吸收,但对水稻根的Cu2+吸收没有明显影响;200μMEDTA对白羽扇豆和水稻根的Cu2+吸收有显著抑制作用;加硅培育的水稻根尖Cu2+吸收速率显著低于无硅培育的水稻。可见,植物的Cu2+吸收受环境中多个因子的调节,且与植物种类相关。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：X835;Q945
【部分图文】：

镜下将微电极的尖端对准并接触ＬＩＸ液面，从尖端吸入ＣｕＬＩＸ，长度约为４０？５０｜ｉｍ，须??确保Ｃｕ?ＬＩＸ与灌充液之间无气泡。在微电极的灌充液中插入Ａｇ／ＡｇＣｌ丝，贝ｉｊ?Ｃｕ２＋选择性??玻璃微电极制作完成（图２－１）。??Ｃｕ?ＬＩＸ??灌冲液??图２－１?Ｃｕ２＇选择性玻璃微电极??２．１．３?Ｃｕ２＋选择性微电极的校准??于非损伤微测系统（北京旭月）上进行离子选择性微电极的校准。将上述制作好的微??电极固定到电极夹持器上，并与ＮＭＴ测试系统的前置信号放大器相连。将参比电极置于??固定架上，使尖端浸入校正溶液，调节微操纵仪将微电极尖端也浸入液面（图２－２）。此??时可通过显微成像和视频采集系统，确认微电极尖端无破损，且ＣｕＬＩＸ无泄漏。打幵测??定软件ｉＦｌｕｘ，开始测定电势，待读数稳定后记录此时的电势值。进行Ｃｕ２＋选择性微电极??校准时，按照校正液浓度从高到低的顺序依次测定。本试验中校正液为Ｃｕ（Ｎ０３）２溶液，设??

镜下将微电极的尖端对准并接触ＬＩＸ液面，从尖端吸入ＣｕＬＩＸ，长度约为４０？５０｜ｉｍ，须??确保Ｃｕ?ＬＩＸ与灌充液之间无气泡。在微电极的灌充液中插入Ａｇ／ＡｇＣｌ丝，贝ｉｊ?Ｃｕ２＋选择性??玻璃微电极制作完成（图２－１）。??Ｃｕ?ＬＩＸ??灌冲液??图２－１?Ｃｕ２＇选择性玻璃微电极??２．１．３?Ｃｕ２＋选择性微电极的校准??于非损伤微测系统（北京旭月）上进行离子选择性微电极的校准。将上述制作好的微??电极固定到电极夹持器上，并与ＮＭＴ测试系统的前置信号放大器相连。将参比电极置于??固定架上，使尖端浸入校正溶液，调节微操纵仪将微电极尖端也浸入液面（图２－２）。此??时可通过显微成像和视频采集系统，确认微电极尖端无破损，且ＣｕＬＩＸ无泄漏。打幵测??定软件ｉＦｌｕｘ，开始测定电势，待读数稳定后记录此时的电势值。进行Ｃｕ２＋选择性微电极??校准时，按照校正液浓度从高到低的顺序依次测定。本试验中校正液为Ｃｕ（Ｎ０３）２溶液，设??

?２．?２．?２?Ｃｕ２＋选择性微电极的校准曲线??Ｃｕ２＋选择性微电极对Ｃｕ２＋浓度的响应情况如图２－３所示＾?ＬＩＸ－Ａ和ＬＩＸ－Ｂ的Ｃｕ２＋选择??性微电极均对Ｃｕ２＋浓度在较宽的范围内有响应，测得的电势值随着Ｃｕ２＋浓度的增加而增??力口。ＬＩＸ－Ａ和ＬＩＸ－Ｂ的电势值随Ｃｕ２＋浓度的变化规律较为一致，不同之处在于前者的电势??值较后者更高一些。??３５０?－１????３００?－?１１?＇?＂??，。－ｆ?一＾??＊??Ｉ２００＇?Ｉ??１５０?－??！??１００?－?—ＬＩＸ－Ａ??一？一?ＬＩＸ－Ｂ??Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ￣??０?２０００?４０００?６０００?８０００?１００００?１２０００??Ｃ?（Ｃｕ）?（｜４１）??图２－３?０＾选择性微电极对Ｃｕ２＾浓度的响应??不同Ｃｕ２＋浓度下测得的电势值与Ｃｕ２＋浓度的对数间的关系可见图２－４。可以看出，在??Ｃｕ２＋浓度为０．５？１００００?ｐＭ的范围内，两种Ｃｕ２＋选择性微电极测得的电势值均与Ｃｕ２＋浓度??的对数呈线性关系。ＬＩＸ－Ａ微电极的校准曲线的相关性系数为〇＿９９０２±０．００１６，斜率为２９．２２??±０．７６ｍＶ／ｄｅｃａｄｅ，检测限为０．８５?ｐＭ；?ＬＩＸ－Ｂ微电极的相关性系数为０＿９７４５±０．００５８，斜??率为２９．１５±０．６３?１１１＼７（＾３（＾
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本文编号：2886267