联苯代谢对红球菌R04细胞形态的影响及杆状决定蛋白MreB的表达和定位
发布时间：2020-11-21 17:05
红球菌R04(Rhodococcus sp.R04)能够有效降解多种芳香族化合物,特别是对生物体有潜在危害的联苯(BP)及多氯联苯(PCB),其降解过程对环境破坏小,经济有效且不会造成二次污染,被认为是一种很有前景的芳香族化合物降解方法。目前国内对于红球菌的研究主要集中于其代谢芳香族化合物的途径以及代谢途径中的多种酶,很少有人研究这些芳香族化合物对红球菌产生了怎样的影响。我们课题组对红球菌R04降解联苯/多氯联苯已经研究多年,研究发现,在红球菌R04降解联苯过程中,红球菌R04细胞的分裂和形态发生了巨大的变化。但是,在联苯降解过程中,具体是哪种代谢物对红球菌R04细胞的分裂和形态造成了影响,还未见报道。在本文中,我们分别用联苯(BP)及其代谢物2,3-二羟基联苯(DHBP)和2-羟基-6-酮基-6-苯基-2,4-己二烯酸(HOPDA)为碳源培养野生型红球菌R04细胞、相应代谢酶缺陷型红球菌R04细胞以及大肠杆菌BL21细胞,然后通过荧光显微镜观察细胞的形态和分裂情况。结果发现与联苯及其它代谢物培养相比,DHBP培养红球菌R04野生型和相应缺陷型细胞时,细胞边界模糊,看不到清晰完整的细胞分裂隔膜,只观察到细胞质中的荧光斑点;DHBP培养大肠杆菌BL21细胞时,虽然细胞膜着色明显,能看到清晰并完整的细胞分裂隔膜,但细胞明显变小。可见2,3-二羟基联苯(DHBP)是主要影响红球菌R04细胞形态和分裂的物质。此外,为了进一步理解联苯及其代谢物对细胞形态的影响,本研究选择了细胞骨架蛋白之一的MreB进行研究。原核细胞骨架蛋白MreB与真核细胞肌动蛋白同源,MreB蛋白在细胞膜下方装配形成螺旋状结构,能在细胞分裂过程当中指导新生肽聚糖的合成,从而使细胞保持特定形态。我们用制备的MreB抗体通过Western-blot检测不同培养条件下不同生长时期红球菌R04细胞中MreB蛋白的表达量,结果显示无论是以葡萄糖还是联苯为碳源培养,从指数期到转换期再到稳定期,红球菌R04细胞中MreB蛋白的表达水平均持续下调。另外,与葡萄糖培养条件相比,联苯培养条件下检测的三个生长时期MreB蛋白的表达水平均下调。同时,在荧光显微镜下观察到红球菌R04从指数期生长到稳定期,细胞形态从杆状变为球状,且联苯对红球菌R04细胞分裂有抑制作用,说明MreB蛋白与细胞杆状形态维持以及细胞分裂有关。最后,我们构建重组表达载体pGEX-6P-1-mreB,转化大肠杆菌BL21细胞,通过荧光显微镜观察MreB蛋白过表达对大肠杆菌细胞形态的影响,结果显示,在大肠杆菌中过表达红球菌R04 MreB蛋白,并不会使大肠杆菌的细胞形态发生明显改变。另外,构建重组表达载体pET-m3c-mreB-gfp,转化大肠杆菌BL21细胞,通过荧光显微镜观察MreB-GFP融合蛋白在大肠杆菌中的定位,结果显示MreB-GFP荧光定位于细胞质中,或者荧光在细胞中部分裂位点及两极点状聚集,这可能与其形成包涵体有关。
【学位单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：X592;X172
【部分图文】：
目前人们已经研究出了许多消除多氯联苯的途径，包括传统的封存法、稳定掩埋法等物理方法，金属还原法、氧化氯化法等化学方法，以及利用好氧微生物、厌氧微生物和植物的天然酶系降解的生物降解法[12]。其中关于生物降解途径的研究最为广泛，因为生物降解过程不会对环境造成额外的污染，所以被认为是一种很有前景的多氯联苯降解途径。目前为止研究人员已经发现并分离得到了很多能降解联苯/多氯联苯等环境污染物的微生物，Rhodococcus sp. R04（红球菌 R04）就是其中一种从土壤中分离得到的革兰氏阳性细菌。红球菌 R04 细胞内有一套联苯代谢酶系可以对联苯进行代谢，通过我们课题组之前的研究表明该酶系与世界上公认的联苯代谢过程当中的酶系相同，该降解过程主要包括联苯双加氧酶（bphA 基因的产物）、2,3-二氢-2,3-二羟基联苯脱氢酶（bphB 基因的产物）、2,3-二羟基联苯-1,2-双加氧酶（bphC 基因的产物）和 2-羟基-6-氧-2,4-已二烯酸水解酶（bphD 基因的产物）[13]。这四种酶降解联苯的详细过程如图 1.1 所示[14]，其中酶 E1 和酶 E3 所催化的反应是该降解过程中的两个限速步骤。
1.2.2 细菌细胞骨架真核细胞包括三类重要的细胞骨架系统：微丝、微管和中间丝，它们分别由肌动蛋白、微管蛋白和中间丝蛋白装配而成[31]。这些系统有助于保持细胞的形态完整，它们还参与细胞运动、染色体分离、信号转导和胞质分裂等生命过程。长期以来，人们普遍认为细菌细胞中没有形成细胞骨架的元素，直到在细菌细胞中发现所有三种真核细胞骨架蛋白的同系物，如图 1.2 所示[31]。越来越多的证据表明这些蛋白参与细菌细胞的 DNA 分离、细胞极化、孢子形成等过程。第一章 文献综述
在正确的位置和时间精确分裂母细胞。这个蛋基于一种会收缩的蛋白质环结构，在细菌中这真核生物微管蛋白类似物。细胞分裂过程[44]中该环状结构与细胞膜的内表面相连（图 1.3 B）合物装配的支架。Z 环的形成过程受到精密的调位点以及与其它细胞周期事件相协调。接着，Z裂位点形成分裂小体。这些分裂小体的成份大接或间接相互作用被招募到 Z 环（图 1.3 C），它将促进横向细胞壁的合成以及细胞质膜的向内生长最终会产生一个完整的隔膜将母细胞E）。隔膜的形成伴随着分裂小体的收缩和解聚蛋白必须重新分配、定位到细胞质中和细胞膜水解酶发挥作用，使隔膜胞壁质分裂从而子细
【参考文献】
本文编号：2893323
【学位单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：X592;X172
【部分图文】：
目前人们已经研究出了许多消除多氯联苯的途径，包括传统的封存法、稳定掩埋法等物理方法，金属还原法、氧化氯化法等化学方法，以及利用好氧微生物、厌氧微生物和植物的天然酶系降解的生物降解法[12]。其中关于生物降解途径的研究最为广泛，因为生物降解过程不会对环境造成额外的污染，所以被认为是一种很有前景的多氯联苯降解途径。目前为止研究人员已经发现并分离得到了很多能降解联苯/多氯联苯等环境污染物的微生物，Rhodococcus sp. R04（红球菌 R04）就是其中一种从土壤中分离得到的革兰氏阳性细菌。红球菌 R04 细胞内有一套联苯代谢酶系可以对联苯进行代谢，通过我们课题组之前的研究表明该酶系与世界上公认的联苯代谢过程当中的酶系相同，该降解过程主要包括联苯双加氧酶（bphA 基因的产物）、2,3-二氢-2,3-二羟基联苯脱氢酶（bphB 基因的产物）、2,3-二羟基联苯-1,2-双加氧酶（bphC 基因的产物）和 2-羟基-6-氧-2,4-已二烯酸水解酶（bphD 基因的产物）[13]。这四种酶降解联苯的详细过程如图 1.1 所示[14]，其中酶 E1 和酶 E3 所催化的反应是该降解过程中的两个限速步骤。
1.2.2 细菌细胞骨架真核细胞包括三类重要的细胞骨架系统：微丝、微管和中间丝，它们分别由肌动蛋白、微管蛋白和中间丝蛋白装配而成[31]。这些系统有助于保持细胞的形态完整，它们还参与细胞运动、染色体分离、信号转导和胞质分裂等生命过程。长期以来，人们普遍认为细菌细胞中没有形成细胞骨架的元素，直到在细菌细胞中发现所有三种真核细胞骨架蛋白的同系物，如图 1.2 所示[31]。越来越多的证据表明这些蛋白参与细菌细胞的 DNA 分离、细胞极化、孢子形成等过程。第一章 文献综述
在正确的位置和时间精确分裂母细胞。这个蛋基于一种会收缩的蛋白质环结构，在细菌中这真核生物微管蛋白类似物。细胞分裂过程[44]中该环状结构与细胞膜的内表面相连（图 1.3 B）合物装配的支架。Z 环的形成过程受到精密的调位点以及与其它细胞周期事件相协调。接着，Z裂位点形成分裂小体。这些分裂小体的成份大接或间接相互作用被招募到 Z 环（图 1.3 C），它将促进横向细胞壁的合成以及细胞质膜的向内生长最终会产生一个完整的隔膜将母细胞E）。隔膜的形成伴随着分裂小体的收缩和解聚蛋白必须重新分配、定位到细胞质中和细胞膜水解酶发挥作用，使隔膜胞壁质分裂从而子细
【参考文献】
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1 皮文清;曲媛媛;张强;周集体;;异生型化合物生物降解及调控机理研究进展[J];环境科学与技术;2010年04期
2 胡劲召,陈少瑾,吴双桃,陈宜菲,谢凝子;多氯联苯污染及其处理方法研究进展[J];江西化工;2004年04期
3 孙艳,钞亚鹏,钱世钧;嗜吡啶红球菌R04的联苯降解途径的研究[J];微生物学报;2003年05期
本文编号：2893323
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