CrgA调控假单胞菌SJTD-1中长链烷烃降解的分子机制研究

发布时间：2021-01-12 18:37

　　微生物修复的方法被认为是解决石油污染的一种有效绿色又节能的手段。截至目前,已有多种石油降解菌株、石油降解的途径及相关酶系被分离鉴定出来,降解相关的调控已有部分推进。然而,中长链烷烃降解作为其中的研究难点,其调控机制依然不明确。本课题组前期分离出了一株可以高效降解长度为C12-C32的烷烃类物质的铜绿假单胞菌株SJTD-1,通过对其全基因组测序及注释,蛋白质组学分析等方式我们筛选出了一些潜在的与烷烃降解代谢相关的基因P450₁、P450₂、alkB1、alkB2、almA1、almA2、ladA1、ladA2等,且alkB2基因已被证实参与了SJTD-1中的中长链烷烃降解。通过Pull-Down实验我们筛选出了若干个包括预测为CrgA在内的可能参与到SJTD-1菌株烷烃降解代谢的转录调控因子。本工作由体外和体内两方面着手,体外通过CrgA蛋白异源表达、凝胶阻滞实验、Footprinting实验、解离试验,体内通过敲除实验、生长曲线测定、RT-qPCR、荧光表达实验,探究了转录调控因子CrgA对筛选出的几个中长链烷烃降解基因尤其是alkB2基因的... 

【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

烷烃的微生物有氧降解途径[8]

1.2.1.2 烷烃厌氧降解途径在厌氧条件下，硝酸盐或硫酸盐被用作终端电子受体。迄今为止，有两种已知的n-烷厌氧降解机制（图1-2）。一种是富马酸盐的加成途径另一种是羧化途径。已经研究过的厌氧n-烷烃降解微生物是硫酸盐还原细菌，菌株CV2803T，菌株Hxd3，菌株Pnd3，以及反硝化细菌菌株HxN1。对具有细菌富集培养的烷烃的厌氧生物降解也被进行了研究。Hxd3 是第一个在饱和碳氢化合物上明显生长的厌氧菌[12]。在单氧酶反应被普遍认为是有氧微生物代谢的初始阶段之前，有人提出，在烷烃的有氧生长过程中，作为一种替代机制，一种非氧独立的终端双键的形成是一种替代机制[13]。这种机制也解释了在烷烃中某些细菌的厌氧增长。先前已经证明，一些微生物通过脱氢作用，然后在厌氧条件下添加水

因的表达载体pET28a-crgA，该质粒使得菌株具有卡那霉素抗性，并将该质粒化学转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，在IPTG的诱导下大量表达。再经镍柱亲和层析纯化后，获得重组蛋白CrgA（见表3-1，图3-1）。crgA含有915对碱基，CrgA蛋白含有304个氨基酸，分子量为34.55kDa。表3-1 CrgA重组蛋白单体性质Table3-1PropertyofCrgAprotein蛋白名称 分子量（kDa） 浓度（mg/ml）CrgA 34.55 2图3-1 重组CrgA蛋白异源表达纯化SDS-PAGE图M：蛋白 Marker （单位：kDa）; I1：诱导前裂解液； I2:诱导后裂解液； L：破碎上清液； U：过柱流出液； W1：第一管洗涤液； W2：最后一管洗涤液；E：洗脱液Fig3-1SDS-PAGEanalysisofthepurifiedrecombinantCrgAproteinM:Fermentaseproteinmarker(kDa)；I1:Pre-inductioncelllysissolution；I2:After-inductioncelllysis


本文编号：2973327