酵母表面展示体系在单链抗体筛选及镉离子富集中的优化和应用

发布时间：2021-03-31 04:26

　　酵母表面展示和噬菌体展示技术已成为蛋白质工程,尤其是抗体工程中广泛应用的强大工具。其中酵母展示技术可以结合流式细胞术,直接分析展示蛋白的表达、稳定性以及与互作蛋白的亲和力,从而成为高效的文库筛选体系。酵母表面展示技术已被广泛用于针对各种抗原的单链抗体（scFv）筛选及其优化。然而,基于酵母表面展示技术的scFv文库筛选流程中仍存在一些缺陷,限制了系统筛选效率。本研究主要针对scFv文库构建与筛选中存在的两个限制因素,对酵母表面展示体系进行优化。首先,scFv文库多样性片段是通过PCR扩增、PCR法随机突变获得,再整合到酵母表面展示载体上,构成scFv文库。然而,这一过程中往往会不可避免地在部分scFv片段内部引入终止密码子,导致不能表达完整的单链抗体。文库中这样的片段占比增加,不仅影响有效库容量,还影响筛选效率。其次,筛选的scFv亚文库一般需要进行高温稳定性验证,获得稳定性更高的目标scFv。而传统验证体系中存在的问题是,当筛选出的scFv库需要进行高温稳定性筛选或验证时,往往由于酵母本身不耐高温而需要将热激后的细胞收集起来提取文库质粒,再重新转入工程酵母中流式分选。这个过程不仅耗时... 

【文章来源】：河北农业大学河北省

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

抗体多肽链亚基组成和结构域分布模型

用于蛋白质工程的酵母表面展示体系的优化和应用而且噬菌体展示的库容量多样性在 109~1011。然中很好地表达，在一些情况下，异源蛋白的展示响宿主细胞生长，甚至清除表达异源蛋白的细胞且有些蛋白的表达需要进行翻译后修饰，但是噬折叠等修饰。，酵母是一种强大的遗传工程工具，它具有真核饰和蛋白质质量控制。酵母表面展示系统常用的本研究中利用的是酿酒酵母的交配蛋白 a-凝集素基连接组成）。通过将目的蛋白克隆在含 Aga2表达，并将载体导入含有 Aga1（与酵母细胞壁，Aga2 与 Aga1 识别并通过二硫键结合，从而将其中 Aga1 编码凝集素的核心亚基（725 个氨基酸亚基（69 个氨基酸残基）[41]。

用于蛋白质工程的酵母表面展示体系的优化和应用间位阻的限制而不易被识别[43]。酵母表面展示还具有真核生物翻译后修饰，如二硫异构化和糖基化等，可折叠和分泌大而复杂的糖基化目的蛋白。库中，每个酵母细胞可表达约 5 万个特定目的蛋白。高通量的表面展示融母细胞的大小使得酵母表面展示平台能够很好地与流式细胞术结合，这样合文库进行定量筛选和精细区分不同的目的蛋白（结合剂）与靶标的结合即精细的亲和力识别）[44,45]。此外，流式细胞分选可以在不进行目的蛋白蛋白分泌表达纯化的前提下很容易地检测出酵母展示蛋白与靶标相互作用等生物物理特征[46-48]。因此，酵母表面显示是一种很好的真核蛋白或多硫平台。常酵母表面展示技术筛选文库中 scFv 及鉴定 scFv 的亲和力，会采用磁力S 筛选的两种方式[41, 45]。首先，在磁力筛选中，将表达 scFv 文库的酵母靶标（抗原）的微米磁珠共同孵育，随后用磁铁对酵母-磁珠混合物进行分酵母与磁珠的强烈相互作用下，使得与靶标亲和力较低的 scFv 片段也能。然后利用流式细胞术对磁力筛选后获得的酵母细胞进行进一步的筛选，与靶标（抗原）具有更高亲和力的 scFv 文库细胞（图 3）。


本文编号：3110787