硅结合蛋白Si-tag在解脂耶氏酵母细胞表面的展示研究
发布时间：2021-06-28 19:12
二氧化硅（SiO2）作为硅酸盐的主要成分,广泛应用于基础设施建设、房地产等领域。随着中国现代化建设进程加剧,对于二氧化硅的需求越来越大,但由于大量的开采和不合理利用,导致二氧化硅资源短缺并带来了严重的环境污染问题,并且情况不断恶化。针对二氧化硅传统采集方法和使用的局限性,急需一种高效环保的富集二氧化硅的方法。本研究希望通过微生物学方法构建一种表面展示硅结合蛋白Si-tag的酵母工程菌,以期建立一种节能环保且能富集SiO2的方法。主要研究工作如下:（1）研究了Si-tag结合SiO2的生物学功能及结合最适条件。将Si-tag与增强型绿色荧光蛋白EGFP融合,并成功在大肠杆菌BL21（DE）中表达。将纯化的融合蛋白与SiO2颗粒共同孵育后洗涤,于荧光显微镜下观察到SiO2颗粒表面有绿色荧光,验证了Si-tag与SiO2颗粒吸附的功能;同时Si-tag吸附SiO2玻璃片的最适时间为50min,最适温度为30°C,最适pH为8.0。（2）成功...
【文章来源】：华中科技大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Si-tag在硅材料表面形成不可逆的吸附原理简图
图 2.1 A：pET28a 质粒图谱；B：EGFP 的电泳检测。M：DNA marker Ds 5000；1：EGF基因；C：pET28aE 的双酶切电泳检测。M：DNA marker Ds 5000；1：经 EcoR I 和 Sal I 双切的 pET28aE 电泳检测Fig.2.1 A: pET28a expression vector; B: Gel electrophoresis of EGFP. M: DNA marker Ds 500lane 1: Gel electrophoresis of EGFP gene. C: Gel electrophoresis of double digested recombinantplasmids pET28aE. M: DNA marker Ds 5000; Lane 1: Double digested recombinant plasmidspET28aE with EcoR I and Sal I.2.2.2 表达载体 pET28aSE 的构建以 pUC57F 为模板，SE-F1：CGCGAATTCATGCACCACCACCACCACCACGC（划线部分为 EcoR I 酶切位点）和 SE-R1：AGCTCCTCGCCCTTAGAAACCTTGATCGTCGTCGCACGA 为上下游引物扩增硅结合蛋白 Si-tag，纯化回收获得目片段 a；以 pUC57C 为模板，SE-F2：TCGTGCGACGACGATCCAAGGTTTCTAAGGCGAGGAGCT 和 SE-R2：CGCGTCGACTTACTTGTAGAGCTCGTCCATACC（线部分为 Sal I 酶切位点）为上下游引物扩增 EGFP，纯化回收获得目的片段 b；目的片段 a 和目的片段 b 为模板，SE-F1 和 SE-R2 为上下游引物扩增得融合基因 SE
2.2 A：PCR 产物电泳检测。M：DNA Marker (Ds 5000)；1：基因 a 的电泳检电泳检测；3：基因 SE 的电泳检测；B：重组质粒 pET28aSE 双酶切电泳检测er (Ds 5000)；1：重组质粒 pET28aSE 的电泳检测；2：经 EcoR I 和 Sal I 双酶切的电泳检测Fig.2.2 A: Gel electrophoresis of PCR productions. M: DNA Marker (Ds 5000); lanetrophoresis of gene a; lane 2: Gel electrophoresis of gene b; lane 3: Gel electrophoresSE; B:Gel electrophoresis of double digested recombinant plasmids pET28aSE. M: D 5000); lane 1: Gel electrophoresis of recombinant plasmids pET28aSE; lane 2: Doubrecombinant plasmids pET28aSE with EcoR I and Sal I. BL21(DE)重组菌株的阳性验证提取重组质粒 pET28aE 和 pET28aSE，在蛋白表达宿主 BL21(DE)中转后挑取单克隆进行阳性验证，结果如图 2.3。PCR 获得的特异性条带与相符，说明重组质粒均已成功导入到了表达宿主 BL21(DE)中，并通过了目的基因准确转入到 BL21(DE)中并无突变。
【参考文献】：
期刊论文
[1]细菌表面展示技术研究新进展[J]. 向红英,王菊芳,杨愈丰,吕延成. 生物化学与生物物理进展. 2019(02)
[2]煤化工工艺中二氧化碳减排技术研究[J]. 王卫峰. 化工设计通讯. 2018(12)
[3]硅酸盐细菌对电解锰渣中有效硅的活化研究[J]. 陈振兴,李佳,杜冬云,叶恒朋,蓝际荣,吕莹. 硅酸盐通报. 2018(11)
[4]利用GAP启动子在毕赤酵母中组成型表达人鹅型溶菌酶2[J]. 黄鹏,阎丽萍,张宁,石金磊. 中国生物工程杂志. 2018(10)
[5]全细胞生物传感器的设计及其在环境监测中的应用[J]. 秦伟彤,田健,伍宁丰. 生物技术进展. 2018(05)
[6]煤粉燃烧器氮氧化污染物减排方法研究[J]. 谭静. 环境科学与管理. 2018(06)
[7]革兰氏阴性菌脂多糖运输系统的构成及作用机制[J]. 莫婷,刘马峰,程安春. 微生物学报. 2018(09)
[8]大肠杆菌表达系统和酵母表达系统的研究进展[J]. 祁浩,刘新利. 安徽农业科学. 2016(17)
[9]凝血因子X和蛋白酶Factor Xa的机理研究概况[J]. 黄晶. 海峡药学. 2016(07)
[10]连接肽在融合蛋白设计中的选择及应用[J]. 于健,Sarra Setrerrahmane,徐寒梅. 药物生物技术. 2016(03)
博士论文
[1]毕赤酵母AOX1启动子转录调控机制研究[D]. 王小龙.华东理工大学 2016
[2]利用冰晶核蛋白构建细菌细胞表面展示体系及其应用研究[D]. 李茜茜.华中农业大学 2009
硕士论文
[1]黑曲霉细胞表面展示CALB的催化特性及其应用[D]. 李远锋.华南理工大学 2018
本文编号：3254891
【文章来源】：华中科技大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Si-tag在硅材料表面形成不可逆的吸附原理简图
图 2.1 A：pET28a 质粒图谱；B：EGFP 的电泳检测。M：DNA marker Ds 5000；1：EGF基因；C：pET28aE 的双酶切电泳检测。M：DNA marker Ds 5000；1：经 EcoR I 和 Sal I 双切的 pET28aE 电泳检测Fig.2.1 A: pET28a expression vector; B: Gel electrophoresis of EGFP. M: DNA marker Ds 500lane 1: Gel electrophoresis of EGFP gene. C: Gel electrophoresis of double digested recombinantplasmids pET28aE. M: DNA marker Ds 5000; Lane 1: Double digested recombinant plasmidspET28aE with EcoR I and Sal I.2.2.2 表达载体 pET28aSE 的构建以 pUC57F 为模板，SE-F1：CGCGAATTCATGCACCACCACCACCACCACGC（划线部分为 EcoR I 酶切位点）和 SE-R1：AGCTCCTCGCCCTTAGAAACCTTGATCGTCGTCGCACGA 为上下游引物扩增硅结合蛋白 Si-tag，纯化回收获得目片段 a；以 pUC57C 为模板，SE-F2：TCGTGCGACGACGATCCAAGGTTTCTAAGGCGAGGAGCT 和 SE-R2：CGCGTCGACTTACTTGTAGAGCTCGTCCATACC（线部分为 Sal I 酶切位点）为上下游引物扩增 EGFP，纯化回收获得目的片段 b；目的片段 a 和目的片段 b 为模板，SE-F1 和 SE-R2 为上下游引物扩增得融合基因 SE
2.2 A：PCR 产物电泳检测。M：DNA Marker (Ds 5000)；1：基因 a 的电泳检电泳检测；3：基因 SE 的电泳检测；B：重组质粒 pET28aSE 双酶切电泳检测er (Ds 5000)；1：重组质粒 pET28aSE 的电泳检测；2：经 EcoR I 和 Sal I 双酶切的电泳检测Fig.2.2 A: Gel electrophoresis of PCR productions. M: DNA Marker (Ds 5000); lanetrophoresis of gene a; lane 2: Gel electrophoresis of gene b; lane 3: Gel electrophoresSE; B:Gel electrophoresis of double digested recombinant plasmids pET28aSE. M: D 5000); lane 1: Gel electrophoresis of recombinant plasmids pET28aSE; lane 2: Doubrecombinant plasmids pET28aSE with EcoR I and Sal I. BL21(DE)重组菌株的阳性验证提取重组质粒 pET28aE 和 pET28aSE，在蛋白表达宿主 BL21(DE)中转后挑取单克隆进行阳性验证，结果如图 2.3。PCR 获得的特异性条带与相符，说明重组质粒均已成功导入到了表达宿主 BL21(DE)中，并通过了目的基因准确转入到 BL21(DE)中并无突变。
【参考文献】：
期刊论文
[1]细菌表面展示技术研究新进展[J]. 向红英,王菊芳,杨愈丰,吕延成. 生物化学与生物物理进展. 2019(02)
[2]煤化工工艺中二氧化碳减排技术研究[J]. 王卫峰. 化工设计通讯. 2018(12)
[3]硅酸盐细菌对电解锰渣中有效硅的活化研究[J]. 陈振兴,李佳,杜冬云,叶恒朋,蓝际荣,吕莹. 硅酸盐通报. 2018(11)
[4]利用GAP启动子在毕赤酵母中组成型表达人鹅型溶菌酶2[J]. 黄鹏,阎丽萍,张宁,石金磊. 中国生物工程杂志. 2018(10)
[5]全细胞生物传感器的设计及其在环境监测中的应用[J]. 秦伟彤,田健,伍宁丰. 生物技术进展. 2018(05)
[6]煤粉燃烧器氮氧化污染物减排方法研究[J]. 谭静. 环境科学与管理. 2018(06)
[7]革兰氏阴性菌脂多糖运输系统的构成及作用机制[J]. 莫婷,刘马峰,程安春. 微生物学报. 2018(09)
[8]大肠杆菌表达系统和酵母表达系统的研究进展[J]. 祁浩,刘新利. 安徽农业科学. 2016(17)
[9]凝血因子X和蛋白酶Factor Xa的机理研究概况[J]. 黄晶. 海峡药学. 2016(07)
[10]连接肽在融合蛋白设计中的选择及应用[J]. 于健,Sarra Setrerrahmane,徐寒梅. 药物生物技术. 2016(03)
博士论文
[1]毕赤酵母AOX1启动子转录调控机制研究[D]. 王小龙.华东理工大学 2016
[2]利用冰晶核蛋白构建细菌细胞表面展示体系及其应用研究[D]. 李茜茜.华中农业大学 2009
硕士论文
[1]黑曲霉细胞表面展示CALB的催化特性及其应用[D]. 李远锋.华南理工大学 2018
本文编号：3254891
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