基于PCR-DGGE技术的原油降解菌群落结构分析

发布时间：2017-04-27 09:15

  本文关键词：基于PCR-DGGE技术的原油降解菌群落结构分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：传统筛菌技术已不能达到现代实验目的,基于16S rDNA基因特定片段的扩增和测序分析,DGGE已成为研究微生物群落结构的重要技术之一。它已在各种自然生境的微生物群落组成研究中得到运用,解决了传统方法的片面性。本文立足于天津渤海湾溢油污染的生物修复问题,利用PCR-DGGE技术对原油降解菌群落结构进行初步研究。优化PCR-DGGE的实验条件,利用指纹图谱、条带测序、系统发育树分析对原油降解菌群落结构进行研究,为以后的相关研究提供基础的方法支持。采集天津渤海湾滩涂沉积物中,以原油为唯一碳源,富集的原油降解菌群用于PCR-DGGE实验。实验周期为2个月,7d取样一次,总8个样品。本研究依据不同的细菌DNA提取试剂盒对原油降解菌总DNA的提取效果,确定适用于本实验的试剂盒。通过对PCR体系中引物量、模板量和PCR程序中退火温度、循环数的优化,得到理想的PCR条件。同时也对DGGE实验条件中凝胶浓度、电泳电压与时间进行了优化,确定了DGGE条件。本研究结论如下:(1)在选用的细菌DNA提取试剂盒中,New Probe试剂盒提取样品的总DNA质量与纯度最优且满足后续实验要求,本研究选用New Probe试剂盒。(2)优化后的PCR条件为:扩增体系包括25μL Master、3μL DNA模板、1μL Primer-1、1μL Primer-2、20μLddH2O。扩增程序即:94℃预变性4min;94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min,25个循环、72℃延伸6min。优化后的DGGE条件为凝胶浓度为8%、变性范围为30%-60%、电泳温度为60℃、电压和时间为60v,16h。(3)在实验周期内,根据原油降解菌的DGGE指纹图谱来分析,不同菌进入新环境之后适应时间存在一定差异,但是整体上原油降解菌群的群落结构相对比较稳定,没有出现明显的减弱趋势。(4)由测序结果可知,在群落结构中α变形菌较多。其中玫瑰杆菌属(Roseobacter.sp.)、节杆菌属(Arthrobacter.sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、微球菌属(Microbacterium sp.)均是常见的原油降解菌属。
【关键词】：DNA提取 PCR-DGGE 石油烃降解菌 群落结构
【学位授予单位】：天津理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X172;X55
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-9
• 第一章 绪论9-21
• 1.1 微生物修复海洋原油污染9-10
• 1.1.1 微生物修复海洋原油污染的优势9
• 1.1.2 微生物修复海洋原油污染的研究进展9-10
• 1.2 海洋环境微生物多样性研究的方法10-11
• 1.2.1 传统平板培养方法10
• 1.2.2 磷脂脂肪酸谱图分析法10-11
• 1.2.3 分子生物学方法11
• 1.3 PCR-DGGE指纹图谱技术11-18
• 1.3.1 16SrDNA序列分析技术的优势性11-12
• 1.3.2 核酸的提取12-13
• 1.3.3 PCR技术13-14
• 1.3.4 DGGE技术14-17
• 1.3.5 PCR-DGGE技术在环境科学中微生物方面的应用17-18
• 1.4 研究目的、内容和技术路线图18-21
• 1.4.1 研究目的18
• 1.4.2 研究内容18-19
• 1.4.3 研究路线图19-21
• 第二章 原油降解菌总DNA提取条件的优化21-29
• 2.1 引言21
• 2.2 实验仪器设备21-22
• 2.3 材料与方法22-24
• 2.3.1 实验材料22
• 2.3.2 原油降解菌的驯化方法22-23
• 2.3.3 原油降解菌总DNA的提取方法23-24
• 2.4 结果与讨论24-28
• 2.4.1 含油样品的处理24
• 2.4.2 原油降解菌基因组提取试剂盒的确定24-27
• 2.4.3 原油降解菌群总DNA提取效果27-28
• 2.5 本章小结28-29
• 第三章 PCR反应条件的优化29-37
• 3.1 前言29
• 3.2 材料29-30
• 3.2.1 实验试剂29-30
• 3.2.2 主要仪器30
• 3.3 PCR实验条件优化30-32
• 3.3.1 PCR扩增体系优化30-31
• 3.3.2 PCR扩增程序优化31
• 3.3.3 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测31-32
• 3.4 结果与讨论32-36
• 3.4.1 两种不同PCR管的扩增效果对比32
• 3.4.2 扩增体系的优化32-34
• 3.4.3 扩增程序的优化34-36
• 3.4.4 原油降解菌的PCR扩增效果36
• 3.5 本章总结36-37
• 第四章 原油降解菌群结构的DGGE分析37-52
• 4.1 前言37
• 4.2 材料37-38
• 4.2.1 实验试剂37-38
• 4.2.2 主要仪器38
• 4.3 DGGE技术38-41
• 4.3.1 制备凝胶溶液38-39
• 4.3.2 凝胶的制备39-40
• 4.3.3 电泳40
• 4.3.4 染色与成像观察40-41
• 4.4 DGGE实验条件的优化41
• 4.4.1 凝胶浓度优化41
• 4.4.2 电泳电压和时间优化41
• 4.5 DGGE指纹图谱与序列分析41-42
• 4.5.1 DGGE指纹图谱分析41-42
• 4.5.2 DGGE条带序列分析42
• 4.6 结果与讨论42-51
• 4.6.1 DGGE实验操作优化42-43
• 4.6.2 凝胶浓度优化结果43-44
• 4.6.3 电泳电压和时间优化结果44
• 4.6.4 原油降解菌的DGGE指纹图谱与序列分析44-51
• 4.7 本章总结51-52
• 第五章 结论与展望52-53
• 5.1 结论52
• 5.2 展望52-53
• 参考文献53-60
• 发表论文及科研情况60-61
• 致谢61-62

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本文编号：330345