铜绿假单胞菌表面展示CadR蛋白并应用于水体及土壤的研究
发布时间：2021-07-30 06:47
本论文中首次使用假单胞菌属中的铜绿假单胞菌作为载体,通过分子生物学手段在其表面展示表达一种对镉离子具有特异性响应吸附能力的重金属结合蛋白CadR。CadR蛋白的表达赋予了铜绿假单胞菌卓越的镉离子吸附能力,这种吸附能力是对镉离子特异性的,工程菌对其他重金属离子无吸附能力,与此同时低浓度的其他离子不会干扰工程菌对镉离子的专一性吸附。由于工程菌采用由带有微型Tn5转座子的自杀型质粒pBAM1将目的基因插入铜绿假单胞菌染色体基因组中表达的方式,染色体表达赋予了工程铜绿假单胞菌优秀的遗传稳定性,这种稳定性对于工程菌的后续应用至关重要。为了得到工程铜绿假单胞菌最佳的环境吸附条件也考察了温度和酸碱度对工程菌镉离子吸附能力的影响,发现工程菌在30℃,pH=7时,镉离子吸附能力达到最佳状态。本研究中,我们进行了实验室规模下的工程铜绿假单胞菌应用于水体和土壤镉污染的修复实验,实验结果证明,工程菌在水体中吸附效果优异,在1000μM的镉离子LB培养液中,振荡培养12小时候,对镉离子的吸附能力达到132μmol/g细胞湿重,并且这种吸附能力是特异性的,而且低浓度的其他二价阳离子不会影响其对镉离子的吸附能力。工...
【文章来源】：湖南大学湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
重叠PCR的引物及其产物的琼脂糖凝胶电泳图
图 2.2pET28a 质粒的质粒图谱使用 XbaI 限制性内切酶单酶切纯化之后，再使用 BamHI 对酶切后 分子进行单酶切，依然使用 20μL 酶切体系，具体配比为：1μL BamH切酶，2μL SmartCut Buffer，15μL 基因片段或质粒，2μL ddH2O。于 切过夜，酶切之后使用天根公司生产的普通 DNA 产物纯化试剂盒进行后的产物经过纯化后通过琼脂糖凝胶电泳进行初步鉴定。得到的质粒载体的线性 DNA 分子和目的基因 INP-cadR 基因片段含有位点，我们使用 T4 DNA 连接酶对其进行连接，20μL 连接体系如下：cadR 基因片段，0.5μL pET28a 质粒线性分子，2μLT4 连接酶，2μL r。于 PCR 仪中 16℃培养过夜。连接产物使用热激法转入大肠杆菌 BL21法的操作步骤如下：（1）从-80 ℃超低温冰箱中取一管冻存的感受态大肠杆菌 BL21(DE3)化复苏 30 分钟（注意感受态细胞不要反复冻融，否则会降低转化效率（2）加入待转化的连接产物 2μL，使用移液枪温和地吹打混匀，冰盒
用 T7-F 和 T7-R 引物对，以原始 pET28a 质粒和 pET28a-INP-cadR 质粒进行 PCR 扩增后对扩增产物进行电泳后得到的的琼脂糖凝胶电泳图果与讨论-cadR 基因片段插入 pET28a 质粒通过 PCR 扩增获得其 T7 启动使用 T7-F 和 T7-R 引物对对原始 pET28a 质粒和 pET28a-INP-cR 验证，图 2.3 显示出，INP-cadR 片段已经插入 T7 系统中。总长INP-cadR 基因片段，随后插入 pBAM1 质粒，以期通过 pBAM1 子将目的基因随机的插入宿主的染色体 DNA 中，对 pBAMpET-INP-cadR 质粒的酶切结果显示，目的基因已经插入原始质粒化之后进行 DNA 水平电泳，琼脂糖凝胶电泳图如图 2.4 所示。 软件绘制目标质粒的基因图谱，图谱中包含目标质粒的基本基粒图谱如图 2.5 所示，得到的目的质粒以自杀型质粒 pBAM1 为7 启动子终止子系统增强表达的目的基因，T7 系统中含有 6-His
【参考文献】：
期刊论文
[1]大肠杆菌ybfE基因的三种原核质粒表达水平的对比及蛋白纯化[J]. 张树军,狄建军. 生物技术. 2017(04)
[2]重组蛋白AdipoR1-EGFP真核表达质粒的构建和表达[J]. 李霓,王潇,许艳妮,韩小婉,刘鹏,司书毅. 中国医药生物技术. 2017(03)
[3]国内外土壤镉污染及其修复技术的现状与展望[J]. 王维薇,林清. 绿色科技. 2017(04)
[4]钢铁材料电镀镉的研究现状[J]. 刘强,林乃明,沙春鹏,唐宾. 表面技术. 2017(01)
[5]基于黄瓜花叶病毒基因组RNA2的外源基因表达载体研究[J]. 朱品,常发光,杜志游,廖乾生. 浙江理工大学学报(自然科学版). 2017(02)
[6]冰晶核蛋白及其在细菌表面展示技术中的应用[J]. 李明亚,林陈水. 氨基酸和生物资源. 2016(02)
[7]不同淋洗剂和淋洗条件下重金属污染土壤淋洗修复研究进展[J]. 孙涛,陆扣萍,王海龙. 浙江农林大学学报. 2015(01)
[8]土壤镉污染修复方法及生物修复研究进展[J]. 彭少邦,蔡乐,李泗清. 环境与发展. 2014(03)
[9]稳定遗传的染色体组合整合酿酒酵母重组菌株的构建[J]. 左颀,赵心清,刘海军,胡世洋,马中义,白凤武. 生物工程学报. 2014(04)
[10]复合诱变高产金属硫蛋白酵母菌株的筛选[J]. 苗兰兰,张东杰,王颖. 食品科学. 2013(19)
博士论文
[1]大肠杆菌中聚羟基脂肪酸酯合成基因的优化和染色体表达[D]. 高雪.清华大学 2013
硕士论文
[1]电动修复土壤重金属（Pb）污染的研究[D]. 李俊翔.广东工业大学 2016
[2]cadR的叶绿体靶向表达及其对转基因拟南芥镉抗性的影响[D]. 李靖锐.山西师范大学 2016
[3]湖南石门磺厂矿区抗砷细菌的分离、鉴定及性质研究[D]. 管思琪.南京大学 2013
[4]镉离子调控蛋白质CadR的表达、纯化、结构和功能研究[D]. 刘茜醇.南京大学 2012
[5]铅镉污染土壤的生物修复技术研究[D]. 郑强.吉林农业大学 2012
[6]秸秆和工程菌联合施用修复铜、镉污染土壤[D]. 王萍.华中农业大学 2011
[7]施用工程菌和草木灰对污染土壤Cd形态和小麦生长的影响[D]. 朱小娇.华中农业大学 2010
[8]磷酸盐对红壤与褐土镉吸附—解吸影响效应机理研究[D]. 陈苗苗.河北农业大学 2009
[9]镉污染环境修复工程菌的构建及其初步应用[D]. 雷磊.华中农业大学 2009
[10]外源基因在苏云金杆菌染色体上的定点整合及表达[D]. 刘萍.湖南师范大学 2008
本文编号：3310922
【文章来源】：湖南大学湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
重叠PCR的引物及其产物的琼脂糖凝胶电泳图
图 2.2pET28a 质粒的质粒图谱使用 XbaI 限制性内切酶单酶切纯化之后，再使用 BamHI 对酶切后 分子进行单酶切，依然使用 20μL 酶切体系，具体配比为：1μL BamH切酶，2μL SmartCut Buffer，15μL 基因片段或质粒，2μL ddH2O。于 切过夜，酶切之后使用天根公司生产的普通 DNA 产物纯化试剂盒进行后的产物经过纯化后通过琼脂糖凝胶电泳进行初步鉴定。得到的质粒载体的线性 DNA 分子和目的基因 INP-cadR 基因片段含有位点，我们使用 T4 DNA 连接酶对其进行连接，20μL 连接体系如下：cadR 基因片段，0.5μL pET28a 质粒线性分子，2μLT4 连接酶，2μL r。于 PCR 仪中 16℃培养过夜。连接产物使用热激法转入大肠杆菌 BL21法的操作步骤如下：（1）从-80 ℃超低温冰箱中取一管冻存的感受态大肠杆菌 BL21(DE3)化复苏 30 分钟（注意感受态细胞不要反复冻融，否则会降低转化效率（2）加入待转化的连接产物 2μL，使用移液枪温和地吹打混匀，冰盒
用 T7-F 和 T7-R 引物对，以原始 pET28a 质粒和 pET28a-INP-cadR 质粒进行 PCR 扩增后对扩增产物进行电泳后得到的的琼脂糖凝胶电泳图果与讨论-cadR 基因片段插入 pET28a 质粒通过 PCR 扩增获得其 T7 启动使用 T7-F 和 T7-R 引物对对原始 pET28a 质粒和 pET28a-INP-cR 验证，图 2.3 显示出，INP-cadR 片段已经插入 T7 系统中。总长INP-cadR 基因片段，随后插入 pBAM1 质粒，以期通过 pBAM1 子将目的基因随机的插入宿主的染色体 DNA 中，对 pBAMpET-INP-cadR 质粒的酶切结果显示，目的基因已经插入原始质粒化之后进行 DNA 水平电泳，琼脂糖凝胶电泳图如图 2.4 所示。 软件绘制目标质粒的基因图谱，图谱中包含目标质粒的基本基粒图谱如图 2.5 所示，得到的目的质粒以自杀型质粒 pBAM1 为7 启动子终止子系统增强表达的目的基因，T7 系统中含有 6-His
【参考文献】：
期刊论文
[1]大肠杆菌ybfE基因的三种原核质粒表达水平的对比及蛋白纯化[J]. 张树军,狄建军. 生物技术. 2017(04)
[2]重组蛋白AdipoR1-EGFP真核表达质粒的构建和表达[J]. 李霓,王潇,许艳妮,韩小婉,刘鹏,司书毅. 中国医药生物技术. 2017(03)
[3]国内外土壤镉污染及其修复技术的现状与展望[J]. 王维薇,林清. 绿色科技. 2017(04)
[4]钢铁材料电镀镉的研究现状[J]. 刘强,林乃明,沙春鹏,唐宾. 表面技术. 2017(01)
[5]基于黄瓜花叶病毒基因组RNA2的外源基因表达载体研究[J]. 朱品,常发光,杜志游,廖乾生. 浙江理工大学学报(自然科学版). 2017(02)
[6]冰晶核蛋白及其在细菌表面展示技术中的应用[J]. 李明亚,林陈水. 氨基酸和生物资源. 2016(02)
[7]不同淋洗剂和淋洗条件下重金属污染土壤淋洗修复研究进展[J]. 孙涛,陆扣萍,王海龙. 浙江农林大学学报. 2015(01)
[8]土壤镉污染修复方法及生物修复研究进展[J]. 彭少邦,蔡乐,李泗清. 环境与发展. 2014(03)
[9]稳定遗传的染色体组合整合酿酒酵母重组菌株的构建[J]. 左颀,赵心清,刘海军,胡世洋,马中义,白凤武. 生物工程学报. 2014(04)
[10]复合诱变高产金属硫蛋白酵母菌株的筛选[J]. 苗兰兰,张东杰,王颖. 食品科学. 2013(19)
博士论文
[1]大肠杆菌中聚羟基脂肪酸酯合成基因的优化和染色体表达[D]. 高雪.清华大学 2013
硕士论文
[1]电动修复土壤重金属（Pb）污染的研究[D]. 李俊翔.广东工业大学 2016
[2]cadR的叶绿体靶向表达及其对转基因拟南芥镉抗性的影响[D]. 李靖锐.山西师范大学 2016
[3]湖南石门磺厂矿区抗砷细菌的分离、鉴定及性质研究[D]. 管思琪.南京大学 2013
[4]镉离子调控蛋白质CadR的表达、纯化、结构和功能研究[D]. 刘茜醇.南京大学 2012
[5]铅镉污染土壤的生物修复技术研究[D]. 郑强.吉林农业大学 2012
[6]秸秆和工程菌联合施用修复铜、镉污染土壤[D]. 王萍.华中农业大学 2011
[7]施用工程菌和草木灰对污染土壤Cd形态和小麦生长的影响[D]. 朱小娇.华中农业大学 2010
[8]磷酸盐对红壤与褐土镉吸附—解吸影响效应机理研究[D]. 陈苗苗.河北农业大学 2009
[9]镉污染环境修复工程菌的构建及其初步应用[D]. 雷磊.华中农业大学 2009
[10]外源基因在苏云金杆菌染色体上的定点整合及表达[D]. 刘萍.湖南师范大学 2008
本文编号：3310922
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