重金属Cd纳米抗体的制备及其免疫学检测方法的建立与应用

发布时间：2023-03-26 16:12

　　随着全球工业的迅速发展，我国乃至全世界日益严重的重金属污染现状，已经引起了卄I：界各W科学家的高度重视，对于这个问题的解决己迫在眉睫。I I前里金属的检测方法：微谱分析(MS)、紫外可见分光光度法(UV)、原子吸收法(AAS)、原了荧光法(AFS)、X荧光光谱(XRF)、电感拙合等离子质谱法(丨CP-MS)等，里然这些方法具奋灵敏度高、特异性好等特点，但所需设备较为昂贵，需要专业技术人员进行操作，样品前处理过程复杂，检测费力费时且成本高。基于这些方而的考虑，『-种简便、快速、特异和灵敏的检测方法的建立已然成为一研究热点。而免疫学检测方法为重金属检测提供丫一种新的策略和途径，该方法是一种其存高度特异性和灵敏度的分析方法，而且操作简单、价格低廉、检测时间短(约3?5min),迪于大规模的现场蹄选。目前，国内外对于重金属的免疫检测主要集中在镉(Cd)、铅(Pb)、汞(Hg)、铬(Cr)等毒性较大的重金属，本课题以重金属镉(Cd)为研宄对象，利用噬菌体-纳米抗体展示技术成功获得了一种新型的特异性针对Cd-DTPA的非传统型单克隆抗体——纳米抗体(Nb)，初步建立了间接竞争性ELISA免疫检测法...

【文章页数】：80 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要符号表
第一章 绪论
    1 研究的背景及意义
    2 重金属污染的主要来源、危害及现状
        2.1 土壤中重金属的污染来源、危害及现状
        2.2 水体中重金属的污染来源、危害及现状
        2.3 农产品中重金属的污染来源、危害及现状
    3 主要的重金属污染及危害
        3.1 铅
        3.2 汞
        3.3 铬
        3.4 砷
        3.5 镉
    4 重金属的检测方法及特点
        4.1 传统检测法
            4.1.1 紫外可见分光光度法
            4.1.2 原子吸收光谱法
            4.1.3 原子荧光法
            4.1.4 电化学法
            4.1.5 X 荧光光谱法
            4.1.6 电感耦合等离子质谱法
        4.2 免疫检测法
            4.2.1 重金属 KinExA 免疫检测法
            4.2.2 重金属免疫色谱法
            4.2.3 免疫胶体金层析技术
            4.2.4 直接竞争性 ELISA 检测法
            4.2.5 间接竞争性 ELISA 检测法
    5 国内外研究现状、发展水平以及存在的问题
    6 本课题的研究目的、内容及意义
    7 研究方法及技术路线
        7.1 研究方法
        7.2 技术路线
第二章 金属镉完全抗原的制备及鉴定
    1 材料与方法
        1.1 仪器与试剂
            1.1.1 实验仪器
            1.1.2 实验试剂
        1.2 主要试剂配方
    2 实验方法
        2.0 完全抗原的制备
        2.1 完全抗原的鉴定
            2.1.1 SDS-PAGE 鉴定
            2.1.2 抗原浓度测定
            2.1.3 紫外鉴定
            2.1.4 质谱鉴定
    3 结果与分析
        3.1 完全抗原 SDS-PAGE 鉴定
        3.2 抗原浓度测定
            3.2.1 BSA 标蛋白标准曲线绘制
            3.2.2 Cd-DTPA-BSA 浓度测定
            3.2.3 Cd-DTPA-OVA 浓度测定
            3.2.4 DTPA-BSA 浓度测定
            3.2.5 无金属抗原 DTPA-OVA 浓度测定
        3.3 紫外鉴定
        3.4 质谱鉴定
    4 结论与讨论
第三章 金属镉-纳米抗体库的筛选及检测
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 细胞
            1.1.2 单域重链抗体库
        1.2 仪器与试剂
            1.2.1 实验仪器
            1.2.2 实验试剂
        1.3 主要试剂配方
    2 实验方法
        2.1 原 VHH 抗体库的扩增
            2.1.1 M13K07 单克隆噬菌体的扩增、纯化
            2.1.2 原始 VHH 库的大量制备
        2.2 Cd-纳米抗体库的富集、筛选
            2.2.1 纳米抗体库第一轮富集步骤
            2.2.2 Cd-DTPA-VHH 的再富集
    3 Cd-DTPA VHH 库富集度及特异性检测
    4 结果与分析
        4.1 辅助噬菌体的扩增
        4.2 原始 VHH 库的扩增
        4.3 Cd-DTPA VHH 库富集度及特异性检测
            4.3.1 Cd-DTPA 第一至七轮纳米抗体库噬菌体输入输出量比较
            4.3.2 抗体库富集度及特异性检测
    5 结论与讨论
第四章 单克隆 VHH 挑选及检测
    1 材料与方法
        1.1 材料
        1.2 仪器与试剂
            1.2.1 实验仪器
            1.2.2 实验试剂
        1.3 主要试剂配方
    2 实验方法
        2.1 单克隆 VHH 菌落的挑选
        2.2 单克隆 VHH 上清 ELISA 检测
            2.2.1 单克隆阳性克隆初筛选
            2.2.2 阳性克隆特异性初步检测
    3 结果与分析
        3.1 单克隆阳性克隆初筛选
        3.2 阳性克隆特异性初检测
    4 结论与讨论
第五章 Cd-单克隆抗体(VHH)的特性测定及其应用
    1 材料与方法
        1.1 材料
        1.2 仪器与试剂
            1.2.1 实验仪器
            1.2.2 实验试剂
        1.3 主要试剂配方
    2 实验方法
        2.1 阳性单克隆抗体的扩增、纯化
        2.2 Cd-单克隆噬菌体 VHH-螯合物竞争性 ELISA
        2.3 Cd-DTPA 单克隆 VHH 编码序列的测定
        2.4 Cd-DTPA-VHH 间接竞争性 ELISA 检测法的建立
            2.4.1 棋盘法最佳抗原抗体反应浓度摸索及其亲和常数 Kaff测定
            2.4.2 最佳浓度条件下对包被温度、时间及游离半抗原孵育时间优化
            2.4.3 VHH 与 DTPA 浓度关系摸索
            2.4.4 VHH 与 Cd-DTPA 及 DTPA 间接竞争性 ELISA
            2.4.5 VHH 间接竞争性 ELISA 标准抑制曲线
        2.5 Cd-DTPA-VHH 与其他金属离子的交叉实验
        2.6 水样加强回收实验
    3 结果与分析
        3.1 阳性单克隆抗体的扩增、纯化
        3.2 Cd-单克隆噬菌体 VHH –螯合物竞争性 ELISA
        3.3 Cd-DTPA 单克隆 VHH 编码序列的测定
        3.4 Cd-DTPA-VHH 间接竞争性 ELISA 检测法的建立
            3.4.1 棋盘法最佳抗原抗体反应浓度摸索及其亲和常数 Kaff测定
            3.4.2 最佳浓度条件下对包被温度、时间及游离半抗原孵育时间优化
            3.4.3 VHH 与 DTPA 浓度关系摸索
            3.4.4 VHH 与 Cd-DTPA 及 DTPA 间接竞争性 ELISA
            3.4.5 VHH 间接竞争性 ELISA 标准抑制曲线
        3.5 Cd-DTPA-VHH 与其他金属离子的交叉实验
        3.6 水样加强回收实验
    4 结论与讨论
第六章 结论与展望
    6.1 结论
    6.2 本课题创新点
    6.3 展望
参考文献
攻读学位期间公开发表的论文和承担科研项目及取得成果
致谢



本文编号：3771276