鲫鱼鱼鳞抗菌肽的制备、纯化及其果蔬保鲜应用研究

发布时间：2023-03-27 17:32

　　我国是淡水鱼食用大国,也是淡水鱼养殖大国,而鱼鳞作为鱼的副产物,常被当作废弃物而丢弃。为了合理利用废弃鱼鳞资源,实现其高值化,本研究以鲫鱼鱼鳞为实验原料,通过单因素和响应面优化得到了制备鲫鱼鱼鳞抗菌肽的最佳工艺,然后对其分离纯化并进行了抗菌活性以及抗氧化活性分析,最后通过鲫鱼鱼鳞抗菌肽的喷洒和添加试验,测定和评价了其对果蔬及其制品的防腐保鲜效果。主要结论如下:1、制备鲫鱼鱼鳞抗菌肽粗酶解液,以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性为优化目标,筛选确定胃蛋白酶为本试验酶解用酶。单因素试验确定各最适条件分别为:柠檬酸浓度10%,酸和鱼鳞液料比14:1(mL/g),提取温度50℃,提取时间为12 h,胃蛋白酶添加量0.8%(w/w),酶解时间2 h。在此基础上进行响应面优化,确定鲫鱼鱼鳞抗菌肽粗酶解液的最佳制备工艺为:酸浓度11.3%,液料比15:1(mL/g),酶添加量0.9%(w/w),酶解时间2.4 h。此条件下,鲫鱼鱼鳞中胶原蛋白提取率达到了79.47%。2、最佳工艺条件下制得的鱼鳞抗菌肽粗酶解液经透析后,再分别经Sephadex G-15、Sephadex G-50凝胶过滤层析和纤维素...

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摘要
ABSTRACT
第1章 引言
    1.1 抗菌肽概述
        1.1.1 抗菌肽简介
        1.1.2 抗菌肽的分类
            1.1.2.1 昆虫抗菌肽
            1.1.2.2 鱼类抗菌肽
            1.1.2.3 哺乳动物抗菌肽
            1.1.2.4 两栖类动物抗菌肽
            1.1.2.5 其他来源动物抗菌肽
            1.1.2.6 植物源抗菌肽
            1.1.2.7 微生物源抗菌肽
        1.1.3 抗菌肽的制备方法
            1.1.3.1 自然提取法
            1.1.3.2 化学合成法
            1.1.3.3 基因工程法
            1.1.3.4 酶解法
        1.1.4 抗菌肽的生物活性
            1.1.4.1 广谱抗细菌活性
            1.1.4.2 抗真菌活性
            1.1.4.3 抗病毒活性
            1.1.4.4 抗原虫活性
            1.1.4.5 抗肿瘤活性
        1.1.5 抗菌肽的作用机理
            1.1.5.1 对细胞膜损伤
            1.1.5.2 细胞内损伤
    1.2 抗菌肽的应用前景及存在的问题
        1.2.1 抗菌肽的应用前景
            1.2.1.1 在动植物转基因工程的应用
            1.2.1.2 在食品工业的应用
            1.2.1.3 在临床医疗的应用
            1.2.1.4 在畜牧养殖业的应用
        1.2.2 抗菌肽应用存在的问题
    1.3 鱼鳞研究利用现状
    1.4 本研究的目的及意义
    1.5 本研究的主要内容
第2章 鲫鱼鱼鳞抗菌肽粗酶解液的制备工艺研究
    2.1 实验材料、试剂与仪器
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 实验试剂
        2.1.3 实验仪器设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 鱼鳞中主要成分测定
            2.2.1.1 水分含量测定
            2.2.1.2 灰分含量测定
            2.2.1.3 蛋白质含量测定
            2.2.1.4 粗脂肪含量测定
        2.2.2 鱼鳞粗酶解液制备工艺方法
            2.2.2.1 制备工艺流程
            2.2.2.2 鱼鳞预处理
            2.2.2.3 酸提鱼鳞胶原蛋白
            2.2.2.4 酶解和灭酶
            2.2.2.5 离心
            2.2.2.6 旋蒸浓缩
        2.2.3 抑菌活性测定
            2.2.3.1 菌悬液的制备
            2.2.3.2 抑菌圈测定
        2.2.4 蛋白酶的筛选
        2.2.5鱼鳞粗酶解液制备单因素实验
            2.2.5.1 鱼鳞胶原蛋白提取酸浓度
            2.2.5.2 鱼鳞胶原蛋白酸提液料比
            2.2.5.3 鱼鳞胶原蛋白提取温度
            2.2.5.4 鱼鳞胶原蛋白提取时间
            2.2.5.5 蛋白酶添加量
            2.2.5.6 酶解时间
        2.2.6 响应面法优化鱼鳞粗酶解液制备工艺
        2.2.7 胶原蛋白提取率的测定
            2.2.7.1 试剂配制
            2.2.7.2 羟脯氨酸标准曲线的建立
            2.2.7.3 鱼鳞中羟脯氨酸含量测定
            2.2.7.4 鱼鳞粗酶解液中羟脯氨酸含量测定
            2.2.7.5 胶原蛋白提取率的计算
        2.2.8 数据处理
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 鱼鳞中主要成分测定结果
        2.3.2 蛋白酶筛选结果
        2.3.3 鱼鳞粗酶解液制备单因素实验结果
            2.3.3.1 提取酸浓度对粗酶解液抑菌性的影响
            2.3.3.2 酸提液料比对粗酶解液抑菌性的影响
            2.3.3.3 提取温度对粗酶解液抑菌性的影响
            2.3.3.4 提取时间对粗酶解液抑菌性的影响
            2.3.3.5 蛋白酶添加量对粗酶解液抑菌性的影响
            2.3.3.6 酶解时间对粗酶解液抑菌性的影响
        2.3.4 响应面优化鱼鳞粗酶解液制备工艺结果及分析
            2.3.4.1 响应面优化试验设计及结果
            2.3.4.2 回归模型建立与方差分析
            2.3.4.3 各因素间交互作用响应面分析
            2.3.4.4 鱼鳞粗酶解液最佳制备工艺条件的确定与验证
        2.3.5 胶原蛋白提取率测定结果
            2.3.5.1 羟脯氨酸标准曲线建立
            2.3.5.2 鱼鳞胶原蛋白提取率
    2.4 本章小结
第3章 鲫鱼鱼鳞抗菌肽的分离纯化及其性能分析
    3.1 实验材料、试剂与仪器
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 实验试剂
        3.1.3 实验仪器设备
    3.2 实验方法
        3.2.1 鱼鳞抗菌肽粗酶解液的制备
        3.2.2 透析除盐
        3.2.3 Sephadex G-15 凝胶过滤层析
            3.2.3.1 Sephadex G-15 装柱、平衡
            3.2.3.2 上样、洗脱和收集
            3.2.3.3 Sephadex G-15 的清洗和再生
        3.2.4 Sephadex G-50 凝胶过滤层析
            3.2.4.1 Sephadex G-50 装柱、平衡
            3.2.4.2 上样、洗脱和收集
            3.2.4.3 Sephadex G-50 的清洗和再生
        3.2.5 纤维素DEAE-52 离子交换层析
            3.2.5.1 装柱、平衡
            3.2.5.2 上样、洗脱和收集
            3.2.5.3 纤维素DEAE-52 的清洗和再生
        3.2.6 SDS-PAGE电泳分子质量测定
            3.2.6.1 电泳试剂配制
            3.2.6.2 分离胶与浓缩胶的配制
            3.2.6.3 样品蛋白与Marker处理
            3.2.6.4 SDS-PAGE电泳
            3.2.6.5 脱色、染色与拍照
        3.2.7 鱼鳞抗菌肽广谱抑菌活性测试
        3.2.8 鱼鳞抗菌肽的MIC和 MBC测定
        3.2.9 鱼鳞抗菌肽的抗氧化性能测试
            3.2.9.1 羟自由基(·OH)清除能力的测定
            3.2.9.2 DPPH自由基(DPPH·)清除能力测定
            3.2.9.3 超氧阴离子自由基(O2
-·)清除能力测定
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 Sephadex G-15 凝胶过滤层析结果分析
        3.3.2 Sephadex G-50 凝胶过滤层析结果分析
        3.3.3 DEAE-52 阴离子交换层析结果分析
        3.3.4 SDS-PAGE电泳结果
        3.3.5 鱼鳞抗菌肽广谱抑菌活性结果
        3.3.6 鱼鳞抗菌肽MIC和 MBC测定结果
        3.3.7 鱼鳞抗菌肽抗氧化性测试结果
            3.3.7.1 羟自由基(·OH)清除能力测定结果
            3.3.7.2 DPPH自由基(DPPH·)清除能力测定结果
            3.3.7.3 超氧阴离子自由基(O2-·)清除能力测定结果
    3.4 本章小结
第4章 鲫鱼鱼鳞抗菌肽在果蔬及其制品方面的应用研究
    4.1 实验材料、试剂与仪器
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 实验试剂
        4.1.3 实验仪器设备
    4.2 实验方法
        4.2.1 鱼鳞抗菌肽对新鲜果蔬防腐保鲜效果测试
            4.2.1.1 鱼鳞抗菌肽对新鲜水果防腐保鲜试验
            4.2.1.2 果实外观感官评价
            4.2.1.3 果实失重率测定
            4.2.1.4 果实呼吸强度测定
            4.2.1.5 果实丙二醛(MDA)含量测定
            4.2.1.6 多酚氧化酶(PPO)活性测定
            4.2.1.7 过氧化物酶(POD)活性测定
        4.2.2 鱼鳞抗菌肽对鲜榨果蔬汁防腐保鲜效果测试
            4.2.2.1 鱼鳞抗菌肽对鲜榨蔬菜汁抑菌保鲜试验
            4.2.2.2 鲜榨黄瓜汁的色泽变化测定
            4.2.2.3 鲜榨黄瓜汁稳定系数的测定
            4.2.2.4 鲜榨黄瓜汁的pH变化测定
            4.2.2.5 鲜榨黄瓜汁中菌落总数测定
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 鱼鳞抗菌肽对李子防腐保鲜试验
            4.3.1.1 果实外观感官评价
            4.3.1.2 果实失重率测定结果
            4.3.1.3 果实呼吸强度测定结果
            4.3.1.4 果实丙二醛(MDA)含量测定结果
            4.3.1.5 多酚氧化酶(PPO)活性测定结果
            4.3.1.6 过氧化物酶(POD)活性测定结果
        4.3.2 鱼鳞抗菌肽对鲜榨黄瓜汁抑菌保鲜试验
            4.3.2.1 鲜榨黄瓜汁的色泽变化测定结果
            4.3.2.2 鲜榨黄瓜汁稳定系数的测定结果
            4.3.2.3 鲜榨黄瓜汁的pH变化测定结果
            4.3.2.4 鲜榨黄瓜汁中菌落总数测定结果
    4.4 本章小结
第5章 论文总结、创新点与展望
    5.1 论文总结
    5.2 创新点
    5.3 展望
参考文献
硕士研究生期间发表的论文
致谢



本文编号：3772561

suoshi