核受体PPARγ组装DNA折纸色谱药物筛选模型的构建及应用
本文关键词：核受体PPARγ组装DNA折纸色谱药物筛选模型的构建及应用，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：药物筛选模型是寻找和发现新药的重要方法之一。近年来,随着分子生物学、药学及现代色谱技术等学科的迅猛发展,涌现出大量新型的药物筛选模型。这些新型药物筛选模型具有筛选方法简便、筛选过程迅速,并且可以实现高通量筛选等特点。近几年,DNA折纸技术的发展及应用越来越成熟,DNA折纸主要的优点包括具有空间可寻址、生物相容性好、制备过程简单及表面易于修饰等。本文拟利用DNA折纸以上的特点,将其作为生物载体把核受体PPARγ负载在其表面,然后采用化学键合的方法将二者的缀合物共价键合在无机材料硅胶表面,最后将硅胶填充于不锈钢色谱柱中,从而构建一种新型基于DNA折纸色谱的药物筛选模型。首先,以Ecoil. JM109为噬菌体M13 mp18的宿主,通过聚乙二醇沉淀纯化,采用酚抽提得到M13 mp18 ssDNA,采用琼脂糖凝胶对其进行表征；以BL21 (DE3)菌为PPARγ-LBD蛋白的表达菌株,进行诱导表达、提取、及纯化得到PPARγ-LBD蛋白,采用SDS-PAGE电泳对其进行表征；在PCR仪中采用特定的程序,以M13mp18 ssDNA为脚手架链,在订书钉链的辅助下,组装得到DNA折纸结构；DNA折纸结构表面的“捕获链”与PPARγ蛋白表面修饰的DNA链通过碱基互补配对将PPARγ组装到DNA折纸表面,采用琼脂糖凝胶电泳和AFM对其进行表征;以SMCC为交联剂,将PPARγ-DNA折纸缀合物键合到巯丙基硅胶表面,得到核受体PPARγ组装DNA折纸色谱固定相；将此固定相装填于不锈钢色谱柱中,完成核受体PPARγ组装DNA折纸色谱药物筛选模型的构建。其次,本文对核受体PPARγ组装DNA折纸色谱药物筛选模型的亲和性和特异性进行了评价。以未组装核受体PPARγ的色谱柱为阴性对照柱,观察阳性药物罗格列酮在阴性对照柱和核受体PPARγ组装DNA折纸色谱柱上的保留行为,对本研究构建的药物筛选模型的亲和性进行评价；以扑热息痛为阴性药物,罗格列酮为阳性药物,观察二者在核受体PPARγ组装DNA折纸色谱柱上的保留行为,对本研究构建的药物筛选模型的特异性进行评价。结果表明,核受体PPARγ组装DNA折纸药物筛选模型能够专属性地识别罗格列酮。再次,研究核受体PPARγ组装DNA折纸色谱药物筛选模型在中药人参活性成分筛选中的应用。采用PPARγ组装DNA折纸色谱柱分析人参总皂苷,分别收集有保留的组分和未保留的组分。利用反相色谱分别对人参总皂苷、人参皂苷与PPARγ相互作用并且作用能力较强的组分主要是人参皂苷Re。最后,本文对核受体PPARγ组装DNA折纸色谱药物筛选模型的重复性和稳定性进行了考察。随机选择三批核受体PPARγ组装DNA折纸色谱固定相并装填成色谱柱,观察人参皂苷在三批色谱柱上的保留行为,以此来评价核受体PPARγ组装DNA折纸色谱药物筛选模型的重复性,人参皂苷的分析色谱图基本一致,说明本研究构建的药物筛选模型重复性良好：通过观察人参皂苷在同一色谱柱上的保留行为,来考察核受体PPARγ组装DNA折纸色谱药物筛选模型的稳定性,随着分析时间的延长,人参皂苷的保留时间减短且峰形变窄,说明本研究构建的药物筛选模型的稳定性有待进一步优化。
【关键词】：药物筛选模型 DNA折纸 人参皂苷 HPLC
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X703
【目录】：
- 摘要4-6
- Abstract6-12
- 第一章 前言12-20
- 1 药物筛选模型的研究进展12-13
- 2 过氧化物酶增殖物激活受体13-15
- 2.1 PPARγ的结构及配体13-14
- 2.2 PPARγ的功能14-15
- 3 DNA折纸纳米结构的研究进展及其应用15-18
- 3.1 DNA折纸纳米结构的研究进展15-17
- 3.2 DNA折纸纳米结构的应用17-18
- 4 本研究的选题依据及意义18-20
- 第二章 核受体PPARγ组装DNA折纸色谱药物筛选模型的建立20-43
- 第一节 M13mp18 ssDNA的制备20-26
- 1 实验仪器与试剂21-22
- 1.1 实验仪器21
- 1.2 实验试剂21-22
- 2 实验内容22-26
- 2.1 溶液的配制及处理22-23
- 2.2 M13mp18 ssDNA的制备23-25
- 2.3 M13mp18 ssDNA的表征25-26
- 3 总结26
- 第二节 hPPARγ-LBD重组蛋白的表达、提取及纯化26-31
- 1 实验仪器与试剂26-28
- 1.1 实验仪器26
- 1.2 实验试剂26-28
- 2 实验内容28-31
- 2.1 溶液的配制及处理28
- 2.2 重组hPPARγ-LBD的表达及提取28-29
- 2.3 hPPARγ-LBD重组蛋白的纯化29-31
- 3 总结31
- 第三节 DNA折纸组装核受体PPARγ的制备31-37
- 1 实验仪器与试剂32
- 1.1 实验仪器32
- 1.2 实验试剂32
- 2 实验内容32-37
- 2.1 溶液的配制及处理32-33
- 2.2 DNA折纸结构的组装33-34
- 2.3 DNA-hPPARγ-LBD的制备34-35
- 2.4 hPPARγ-LBD组装DNA折纸的制备35
- 2.5 DNA折纸结构及DNA-hPPARγ-LBD的表征35-37
- 3 总结37
- 第四节 巯丙基硅胶的制备37-40
- 1 实验仪器与试剂38
- 1.1 实验仪器38
- 1.2 实验试剂38
- 2 实验内容38-39
- 2.1 硅胶的预处理38
- 2.2 巯丙基硅胶的合成及纯化38-39
- 2.3 巯丙基硅胶的表征39
- 3 总结39-40
- 第五节 核受体PPARγ组装DNA折纸色谱柱的研制40-43
- 1 实验仪器与试剂40-41
- 1.1 实验仪器40
- 1.2 实验试剂40-41
- 2 实验内容41-42
- 2.1 核受体PPARγ组装DNA折纸色谱固定相的制备41
- 2.2 不锈钢空柱管的预处理41
- 2.3 匀浆液的制备41
- 2.4 核受体PPARγ组装DNA折纸色谱柱的装填41-42
- 3 总结42-43
- 第三章 核受体PPARγ组装DNA折纸色谱药物筛选模型的评价及应用43-55
- 第一节 核受体PPARγ组装DNA折纸色谱药物筛选模型的评价43-47
- 1 实验仪器与试剂43
- 1.1 实验仪器43
- 1.2 实验试剂43
- 2 实验内容43-46
- 2.1 溶液的配制及处理43-44
- 2.2 核受体PPARγ组装DNA折纸色谱柱的预处理44
- 2.3 色谱条件44-45
- 2.4 核受体PPARγ组装DNA折纸色谱药物筛选模型的评价45-46
- 3 总结46-47
- 第二节 核受体PPARγ组装DNA折纸色谱药物筛选模型在筛选中药人参活性成分中的应用47-51
- 1 实验仪器与试剂47
- 1.1 实验仪器47
- 1.2 实验试剂47
- 2 实验内容47-50
- 2.1 溶液的配制及处理47-48
- 2.2 筛选中药人参中活性成分48-50
- 3 结论50-51
- 第三节 核受体PPARγ组装DNA折纸色谱药物筛选模型重复性和稳定性的考察51-55
- 1 实验仪器与试剂51
- 1.1 实验仪器51
- 1.2 实验试剂51
- 2 实验内容51-54
- 2.1 溶液的配制及处理51-52
- 2.2 色谱条件52
- 2.3 药物筛选模型的重复性考察52-53
- 2.4 药物筛选模型的稳定性考察53-54
- 3 总结54-55
- 全文总结55-57
- 参考文献57-60
- 附录60-61
- 个人简历61-62
- 硕士期间发表论文62-63
- 致谢63
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