DBP降解菌DNB-S1转录组学研究及功能基因的筛选

发布时间：2017-07-20 04:06

  本文关键词：DBP降解菌DNB-S1转录组学研究及功能基因的筛选

  更多相关文章： DBP 转录组学 HiSeq2000测序系统 代谢 龙胆酸途径

【摘要】：邻苯二甲酸二丁酯(DBP)是邻苯二甲酸酯类化合物(Phthalic acid esters,PAEs)中常见的一种的塑料增塑剂,被普遍用在家具和汽车内饰等的生产和使用中。由于DBP与PVC树脂间是以氢键或者范德华力连接,因此DBP在产品中很容易扩散到环境中。DBP具有生殖毒性,且具有致癌性、致畸性、致突变性,因此DBP已被美国环保局(USEPA)列为优先控制污染物。由于DBP的性质稳定,在自然环境中不易降解,而微生物降解是降解DBP的主要方式。目前,国内外已有大量研究者成功筛选到DBP高效降解菌株,并且也有学者对降解菌的代谢路径和降解基因展开了研究。但在以往的研究中,研究者通常选用传统的研究方法如基因文库、基因克隆等方法来挖掘功能基因,这些方法往往耗时长且仅能获取很少的功能基因。随着第二代测序技术的发展,RNA-seq测序技术逐渐得到了研究者的关注,该方法不仅运行成本低,通量高,精确性高,而且可以对无参考基因组信息的物种进行转录组测序,已被大量研究者使用来研究生物的转录表达谱、功能基因的挖掘及差异表达基因分析。本研究采用Hi Seq2000测序系统的Illumina/Solexa技术对500、1 000和1 500 mg/L的DBP处理分别与葡萄糖作为对照(CK)的DBP降解菌株Novosphingobium aromaticivorans DNB-S1进行RNA-seq测序和差异表达基因分析,对降解菌株DNB-S1中的功能基因进行深度挖掘。通过RNA-seq测序,我们得到了DBP降解菌DNB-S1转录组的全面丰富的Unigenes信息。采用Trinity短序列组装软件对reads进行序列组装和拼接,CK与不同浓度DBP处理分别获得不同数量的Unigene,分别是23 287(CK)、9 402(500 mg/L)、9 209(1 000 mg/L)、9 576(1 500 mg/L)。在500、1 000和1500 mg/L DBP处理与CK的差异表达基因中,差异基因的个数分别是8 166、8 895和8 467,其中上调基因个数分别是751,752和747个,而相应的下调基因个数分别为7 414、7 642和7 719。差异基因的GO功能显著性富集分析表明,Unigene占主导的是“催化活性”,“代谢过程”,“细胞生理过程”和“结合功能”。KEGG注释结果显示,Unigene富集的主要的路径是“代谢途径”,“次生代谢产物的生物合成”和“不同环境中的微生物代谢”。对功能基因的挖掘,发现了26个转录调控因子,35个趋化蛋白,47个降解相关基因和2个解毒酶基因显著上调表达。根据降解基因的功能,推断DNB-S1降解DBP是通过龙胆酸降解途径进行代谢,其中龙胆酸1,2-双加氧酶在降解中起到开环的作用。在实时荧光定量PCR的验证结果中,基因表达情况与转录组测序中的基因表达水平保持一致。本研究利用RNA-seq测序技术对DBP降解菌进行转录组学研究,发现了DBP代谢途径为龙胆酸代谢途径,本研究为降解菌的功能基因和降解机理提供了丰富的基因数据,同时也为DBP污染的生物修复提供了新的方向。
【关键词】：DBP 转录组学 HiSeq2000测序系统 代谢 龙胆酸途径
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X172
【目录】：

• 摘要8-9
• 英文摘要9-11
• 1 前言11-20
• 1.1 转录组学概述11-14
• 1.1.1 转录组与转录组学11
• 1.1.2 转录组学研究的基本方法11-12
• 1.1.3 第二代测序平台12-14
• 1.1.4 细菌转录组研究现状14
• 1.2 DBP降解菌功能基因相关研究14-18
• 1.2.1 DBP及其危害14-16
• 1.2.2 DBP的生物降解16-17
• 1.2.3 DBP降解菌功能基因研究17-18
• 1.3 实时荧光定量PCR18
• 1.4 研究的目的意义18-19
• 1.5 技术路线19
• 1.6 课题来源19-20
• 2 材料与方法20-28
• 2.1 材料20-21
• 2.1.1 供试菌株与培养基20
• 2.1.2 主要试剂20
• 2.1.3 主要仪器20-21
• 2.2 试验方法21-26
• 2.2.1 培养菌株21
• 2.2.2 上机测序21-22
• 2.2.3 序列拼接与组装22-23
• 2.2.4 基因的功能注释和COG分类23-25
• 2.2.5 Unigene表达差异分析25-26
• 2.2.6 差异Unigene的GO和Pathway分析26
• 2.3 qPCR26-28
• 3 实验结果28-43
• 3.1 产量统计与组装结果分析28
• 3.2 Unigene的功能注释结果与分析28-30
• 3.2.1 Unigene的功能注释28-29
• 3.2.2 预测蛋白注释29
• 3.2.3 COG29-30
• 3.3 Unigene的GO分类30-31
• 3.4 Unigene的代谢通路分析31
• 3.5 Unigene的表达差异分析31-34
• 3.5.1 GO功能分析32-34
• 3.5.2 Pathway富集分析34
• 3.6 功能基因的预测34-42
• 3.6.1 转录调控因子34-36
• 3.6.2 趋化蛋白36-38
• 3.6.3 降解基因及代谢路径38-41
• 3.6.4 其它功能基因41-42
• 3.7 定量验证测序结果42-43
• 4 讨论43-48
• 4.1 转录组测序实验的实验设计43
• 4.2 基因注释结果和差异表达基因分析43-44
• 4.3 功能基因预测分析44-47
• 4.3.1 转录调控因子44-45
• 4.3.2 趋化蛋白45
• 4.3.3 降解基因及代谢路径分析45-46
• 4.3.4 降解DBP功能基因46-47
• 4.4 功能基因的验证47-48
• 5.结论48-49
• 致谢49-50
• 参考文献50-59
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文59

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