白浅灰链霉菌对聚乙烯降解效果研究及降解酶的基因克隆

发布时间：2017-07-30 11:08

  本文关键词：白浅灰链霉菌对聚乙烯降解效果研究及降解酶的基因克隆

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【摘要】：近几年工业的迅速发展带来了严重的“白色污染”问题,影响着我们的生产与生活,在众多缓解“白色污染”、处理废弃塑料的方法中,利用微生物降解塑料成为热门研究领域之一。本试验首先从土壤中筛选、分离出一株能够降解聚乙烯的放线菌,通过进行菌落形状、大小、颜色等形态学的观察、生理生化鉴定和16S r DNA的全序列克隆测序,鉴定其为Streptomyces albogriseolus白浅灰链霉菌。其次初探白浅灰链霉菌对聚乙烯的降解效果研究:(1)对相对分子量分别为2000、5000、10W和40W的聚乙烯粉末进行研究,结果表明不同分子量的聚乙烯粉末都可以被白浅灰链霉菌降解,且降解程度从大到小依次为:2000500010W40W;(2)对相对分子质量100W的聚乙烯膜片进行研究,结果表明白浅灰链霉菌附着在聚乙烯膜片上进行生长且在肉眼和扫描电子显微镜下观察均发现膜片表面有破损和孔洞,由此说明聚乙烯膜片也可以被白浅灰链霉菌所降解。所以可知白浅灰链霉菌不仅属于低分子量聚乙烯降解菌,也属于高分子量甚至超高分子量降解菌。再次探究白浅灰链霉菌降解聚乙烯的关键酶:先用漆酶和HBT(1-羟基苯并三唑)构建了一个中间体或介导体,在30℃的环境中降解相对分子质量为2000的聚乙烯粉末,在3 d以后可以看到实验组的聚乙烯粉末颗粒变小,溶液呈浅黄色。根据有关文献和实验结果表明漆酶是降解聚乙烯的关键酶。利用ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)法检测白浅灰链霉菌发酵液中含有漆酶蛋白且测定其酶活。比较NCBI gene数据库中已发表的链霉菌漆酶基因序列,设计引物K-F2、K-R2,利用PCR技术体外扩增出白浅灰链霉菌基因组DNA中的漆酶基因,进行BLAST比对与分析。将得到的漆酶基因与克隆质粒p EASY-T1 Cloning Vector连接,构建了重组克隆质粒p EASY-T1 Cloning Vector/laccase,导入到感受态细胞Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell中并进行阳性克隆验证。采用限制性内切酶XhoⅠ和Bam HⅠ对重组克隆质粒p EASY-T1 Cloning Vector/laccase与原核表达载体p ET-32a-c(+)Vector进行双酶切,露出粘性末端,采用T4 DNA Ligase进行连接,导入到感受态细胞中BL21(DE3)Chemically Competent Cell中并进行阳性克隆验证。最后,将携带有重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)进行检测:(1)将其接种在聚乙烯为唯一碳源和能源的基础无碳源固体培养基上进行生长,结果显示有菌落长出,说明大肠杆菌BL21(DE3)可以利用聚乙烯粉末;(2)将携带p ET-32a-c(+)Vector/laccase的大肠杆菌BL21(DE3)的发酵液用硫酸铵分级沉淀制成粗酶液,用SDS-PAGE检测到粗酶液中含有漆酶蛋白且分子量大小约为66.4 KDa。通过一系列的基因克隆技术,将白浅灰链霉菌中的漆酶基因导入到大肠杆菌中并表达成功。说明漆酶是降解聚乙烯的关键酶,这将为以后探索微生物对聚乙烯降解机制、筛选漆酶高产菌株奠定了基础。
【关键词】：基因克隆 聚乙烯粉末 漆酶基因 白浅灰链霉菌 基因组DNA
【学位授予单位】：四川师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;X172
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 绪论10-18
• 1.1 课题背景10-11
• 1.1.1 课题来源10
• 1.1.2 课题的目的和意义10
• 1.1.3 课题的研究内容及创新点10-11
• 1.2 聚乙烯降解的研究概况11-14
• 1.2.1 聚乙烯的定义与分类11-12
• 1.2.2 聚乙烯研究背景12-13
• 1.2.3 目前所用降解菌的种类13
• 1.2.4 聚乙烯生物降解国内外研究情况对比13-14
• 1.2.5 发展前景及方向14
• 1.3 漆酶的研究概况14-18
• 1.3.1 漆酶的分布14-15
• 1.3.2 漆酶的理化性质15-16
• 1.3.3 漆酶的应用16-18
• 2 白浅灰链霉菌对聚乙烯的降解效果研究18-33
• 2.1 实验材料18-20
• 2.1.1 实验仪器18-19
• 2.1.2 培养基19
• 2.1.3 药品及试剂19-20
• 2.1.4 菌种20
• 2.2 实验方法20-23
• 2.2.1 聚乙烯降解菌株筛选方法20-22
• 2.2.2 菌株F1对聚乙烯降解能力的初探22-23
• 2.3 结果与讨论23-31
• 2.3.1 菌株F1的筛选与分离23
• 2.3.2 菌株F1的鉴定23-29
• 2.3.3 菌株F1对聚乙烯降解能力的初探29-31
• 2.4 结论31-33
• 3 白浅灰链霉菌漆酶基因的克隆33-67
• 3.1 实验材料33-38
• 3.1.1 菌种与载体33-34
• 3.1.2 实验试剂34-36
• 3.1.3 培养基36
• 3.1.4 实验仪器36-37
• 3.1.5 引物37-38
• 3.2 实验方法38-48
• 3.2.1 漆酶降解聚乙烯粉末38
• 3.2.2 白浅灰链霉菌发酵液中漆酶的检测及其活性的测定38
• 3.2.3 漆酶基因的克隆38-45
• 3.2.4 携带有重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)中漆酶的检测45-48
• 3.3 结果与讨论48-66
• 3.3.1 漆酶降解聚乙烯粉末48-49
• 3.3.2 白浅灰链霉菌发酵液中漆酶的检测及其活性的测定49-51
• 3.3.3 漆酶基因的克隆51-62
• 3.3.4 携带有重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)中漆酶的检测62-66
• 3.4 结论66-67
• 总结与展望67-69
• 参考文献69-86
• 附录86-89
• 致谢89

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本文编号：593892