芽孢杆菌漆酶基因随机突变库筛选与染料降解

发布时间：2017-09-27 17:24

  本文关键词：芽孢杆菌漆酶基因随机突变库筛选与染料降解

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【摘要】：漆酶作为一种重要催化剂,广泛应用于食品、制浆造纸及纸浆生物漂白等领域,但是漆酶在高pH及高温条件下容易失活,限制了其应用。本文以获得耐高pH或耐高温漆酶突变漆酶为目标,对Error-prone PCR构建成功的Bacillus subtilis LS03 CotA漆酶基因随机突变库进行高通量筛选,并对突变漆酶的酶学性质和常见染料降解能力进行系统分析比较。利用96孔板初筛和大量定性复筛,最终获得5株酶活较高的突变菌株019、 K14、K9、W3、W8,其中突变菌株O19粗酶活性比野生型提高了5.65倍；通过对突变漆酶同源建模获得三维结构表明5个突变漆酶相应的氨基酸突变位点大部分位于酶分子第三结构域的表面,其中只有突变漆酶O19的第260位氨基酸突变位于“口袋”结构内部表面。突变漆酶O19和野生型漆酶CK经His Trap HP分离纯化,测得O19纯酶的比酶活是CK的1.78倍,O19的异源表达量也明显高于CK；同时对底物ABTS和SGZ的催化效率及亲和力都有显著提高；突变型漆酶O19在pH耐受性和对金属离子的影响方面有明显的提升,其中K+、Mn2+、Co2+对O19的促进作用提升了20%多；突变漆酶对部分抑制剂和表面活性剂抗性高于野生型漆酶,但是不具有高温耐受性。在降解4种常见的染料方面,O19降解活性亮蓝和刚果红的能力上均高于CK,降解率平均提高10%左右。研究了突变型漆酶降解靛蓝过程中染料浓度、介体浓度、漆酶浓度三个因素对其降解的影响,正交试验得到三个因素中介体ACE浓度对降解的影响显著,最优水平组合为染料浓度为75mg/L,酶浓度为5U/L,介体浓度为5mmol/L。本研究设计了固定化酶循环脱色设备,主要通过将固定化小球装入载体,再利用恒流泵进行持续循环染料脱色。通过比较固定化酶循环脱色设备与正常分散摇瓶脱色方法进行比较,固定化酶循环脱色设备对染料降解总量提高了20%。
【关键词】：CotA漆酶 酶学性质 染料降解
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X791;Q814.9
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 1 绪论10-13
• 1.1 引言10
• 1.2 漆酶的理化性质10
• 1.3 漆酶的应用10-11
• 1.3.1 漆酶在生物修复方面的应用10
• 1.3.2 漆酶在染料降解的应用10-11
• 1.3.3 漆酶在燃料电池和生物传感器的应用11
• 1.3.4 漆酶在食品业的应用11
• 1.4 细菌漆酶的研究进展11
• 1.5 酶定向进化概况11-12
• 1.5.1 酶定向进化方法11-12
• 1.5.2 酶定向进化高通量筛选方法12
• 1.5.3 酶定向进化主要应用12
• 1.6 本课题目的意义和内容12-13
• 1.6.1 研究目的意义12
• 1.6.2 研究内容12-13
• 2 枯草芽孢杆菌LOS3 CotA随机突变库的筛选13-21
• 2.1 实验材料13-14
• 2.1.1 菌株与载体13-14
• 2.1.2 实验试剂14
• 2.1.3 培养基14
• 2.1.4 实验仪器14
• 2.2 方法14-17
• 2.2.1 含突变基因的表达文库的构建14-16
• 2.2.2 突变基因表达文库的高通量初筛16
• 2.2.3 突变基因表达文库的复筛16-17
• 2.2.4 突变漆酶的氨基酸序列分析17
• 2.3 结果与分析17-20
• 2.3.1 重组pETDuet-1 vector的验证17
• 2.3.2 突变基因表达文库的高通量初筛17-18
• 2.3.3 突变基因表达文库的复筛18
• 2.3.4 突变漆酶的氨基酸序列分析18-20
• 2.4 讨论20
• 2.5 本章小结20-21
• 3 突变型漆酶O19和野生型CotA漆酶酶学性质比较21-36
• 3.1 实验材料21-22
• 3.1.1 菌种21
• 3.1.2 药品21
• 3.1.3 仪器21
• 3.1.4 蛋白纯化试剂21-22
• 3.2 实验方法22-25
• 3.2.1 两种漆酶的诱导与纯化22-23
• 3.2.2 测定纯化后两种漆酶活性及蛋白含量23
• 3.2.3 pH对两种漆酶的影响23-24
• 3.2.4 温度对两种漆酶的影响24
• 3.2.5 两种漆酶pH耐受性和温度耐受性的比较24
• 3.2.6 其他环境因素对两种漆酶活性的影响24-25
• 3.2.7 两种漆酶动力学参数的测定25
• 3.3 结果分析25-34
• 3.3.1 两种漆酶的诱导与纯化25-27
• 3.3.2 两种漆酶最适pH及pH稳定性比较27-28
• 3.3.3 两种漆酶最适温度及温度稳定性比较28-29
• 3.3.4 两种漆酶pH及温度耐受性比较29-31
• 3.3.5 金属离子对两种漆酶活性影响的比较31-32
• 3.3.6 有机溶剂对两种漆酶活性影响比较32
• 3.3.7 酶抑制剂和表面活性剂对两种漆酶活性影响比较32-33
• 3.3.8 两种漆酶酶动力学比较33-34
• 3.4 讨论34-35
• 3.5 本章小结35-36
• 4 突变漆酶O19染料脱色中的应用36-43
• 4.1 实验材料36
• 4.1.1 漆酶36
• 4.1.2 实验试剂36
• 4.1.3 实验仪器36
• 4.2 实验方法36-39
• 4.2.1 两种漆酶对四种染料的降解36-37
• 4.2.2 突变型漆酶O19对靛蓝染料脱色的正交优化37
• 4.2.3 突变型漆酶O19固定化循环降解染料研究37-39
• 4.3 结果分析39-42
• 4.3.1 两种漆酶对四种染料的降解39
• 4.3.2 突变型漆酶O19对靛蓝染料脱色的正交优化39-40
• 4.3.3 突变型漆酶O19固定化循环降解染料研究40-42
• 4.4 本章小结42-43
• 结论43-44
• 参考文献44-48
• 攻读学位期间发表的学术论文48-49
• 致谢49-50

【参考文献】

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1 余小霞;刘晓青;田健;伍宁丰;;来源于枯草芽孢杆菌的漆酶cotA基因克隆与表达及其酶学性质研究[J];中国农业科技导报;2015年01期

2 王晓s，

本文编号：930966