施氏假单胞菌YC-YH1对有机磷农药的降解特性研究

发布时间：2017-10-06 20:13

  本文关键词：施氏假单胞菌YC-YH1对有机磷农药的降解特性研究

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【摘要】：多年来,在农业生产过程中我们大量使用有机磷农药,虽然有效保障了粮食果蔬的产量,但也导致了有机磷农药残留及环境污染。使得大气、土壤、水体等环境都遭到了不同程度的污染,严重危害了人类的生命安全。高效清除环境中残留的有机磷农药已经成为目前研究的热点。利用微生物降解有机磷农药是一种安全、有效并且廉价的降解有机磷农药的方法,并且因其无残留、无毒害、无二次污染而受到广泛关注。有机磷农药与降解酶结合发生酶促反应是一个十分快速的过程,但是大部分有机磷降解酶为胞内酶,这就使得有机磷进入细胞的过程成为限速步骤,严重限制着降解速率。增强菌株对酶的分泌能力能够很好解决这一问题。本研究以有机磷农药降解菌施氏假单胞菌YC-YH1为实验材料,从菌株YC-YH1中克隆得到了两个有机磷降解酶基因mpd和ophc2。将这两个基因分别连接到表达载体pET-32a上得到重组质粒pET-mpd和pET-ophc2,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。甲基对硫磷水解酶(MPH)和有机磷水解酶(OPHC2)分别通过Ni亲和层析柱进行纯化,并进行了酶学性质分析,研究表明MPH最高活力的反应温度为40℃,在pH 8-12范围内,酶均表现出较高的活力;OPHC2的最适反应温度为30℃,在pH 8-12范围内酶活力较高;两种酶按1:1比例混合组成的混合酶在温度30℃-40℃范围内酶活力很高,保持在最高酶活力95%以上,混合酶在p H8-12范围内仍具有较高活力;多种金属离子会对酶活性产生一定影响,酶对SDS和EDTA敏感度很高,混合酶对于金属离子的敏感性低于单个酶对金属离子的敏感性。此外,本研究从大肠杆菌中克隆得到TorA双精氨酸信号肽编码序列sTorA,构建了pHSG299(sTorA-mpd)克隆载体,建立并优化施氏假单胞菌的电转化方法,利用电击转化的方法改造了菌株YC-YH1,并对MPH的周质分泌功能进行了测定。实验结果表明转化后菌株与野生型菌株相比,胞外酶活力提高36.4%,48 h内菌株降解能力提高了8.7%,12h内上清液的降解能力提高了44.4%。MPH通过双精氨酸转运途径进行周质分泌使得菌株对有机磷的降解克服了底物吸收限制。MPH的周质分泌使得菌株降解能力提高,这对污染环境的生物修复和有机磷农药工业废水处理有着十分重要的意义。
【关键词】：有机磷农药 施氏假单胞菌 有机磷水解酶 酶学性质 双精氨酸系统
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X172;X592
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 第一章 引言13-21
• 1.1 有机磷农药13-15
• 1.1.1 有机磷农药的发展概况13
• 1.1.2 有机磷农药作用机理13-14
• 1.1.3 有机磷农药的污染及危害14-15
• 1.2 有机磷农药的微生物降解15-17
• 1.2.1 有机磷农药降解方法15-16
• 1.2.2 有机磷农药降解菌16
• 1.2.3 有机磷农药降解酶16-17
• 1.3 细菌分泌系统17-20
• 1.3.1 常见的分泌途径17-18
• 1.3.2 双精氨酸蛋白转运途径18-20
• 1.4 研究目的和意义20-21
• 第二章 施氏假单胞菌YC-YH1降解酶基因克隆表达21-34
• 2.1 实验材料21-22
• 2.1.1 主要试剂耗材、菌株及载体21
• 2.1.2 培养基及相关溶液21-22
• 2.1.3 主要仪器22
• 2.2 实验方法22-28
• 2.2.1 菌株基因组DNA提取22
• 2.2.2 降解酶基因的获得22-24
• 2.2.3 载体构建24-26
• 2.2.4 mpd和ophc2基因的诱导表达及蛋白纯化26-28
• 2.2.5 MPH和OPHC2的比较分析28
• 2.3 结果与分析28-33
• 2.3.1 基因组DNA提取28
• 2.3.2 克隆得到mpd和ophc2基因28-29
• 2.3.3 构建得到pET-mpd和pET-ophc229-30
• 2.3.4 蛋白质表达纯化30-31
• 2.3.5 MPH和OPHC2的比较分析31-33
• 2.4 讨论33-34
• 第三章 菌株YC-YH1降解酶的酶活性质分析34-40
• 3.1 实验材料34
• 3.1.1 试剂与材料34
• 3.1.2 主要仪器34
• 3.2 实验方法34-35
• 3.2.1 蛋白质定量34
• 3.2.2 对硝基苯酚标准曲线的制作34
• 3.2.3 酶的活性测定34
• 3.2.4 酶学性质的测定34-35
• 3.2.5 降解甲基对硫磷的动力学分析35
• 3.3 结果与分析35-39
• 3.3.1 蛋白质定量35-36
• 3.3.2 对硝基苯酚标准曲线36
• 3.3.3 酶学性质的研究36-39
• 3.4 讨论39-40
• 第四章 菌株YC-YH1利用Tat系统分泌MPH载体构建40-49
• 4.1 实验材料40
• 4.1.1 主要试剂及菌株、载体40
• 4.1.2 主要仪器40
• 4.2 实验方法40-45
• 4.2.1 MPH的定位40-41
• 4.2.2 菌株基因组DNA提取41-42
• 4.2.3 重组质粒构建42-44
• 4.2.4 菌株YC-YH1生长曲线测定44-45
• 4.2.5 YC-YH1菌株感受态细胞的制备45
• 4.2.6 重组质粒转化进入菌株YC-YH145
• 4.3 结果与分析45-48
• 4.3.1 MPH的定位45-46
• 4.3.2 菌株YC-YH1生长曲线46-47
• 4.3.3 重组质粒的获得47-48
• 4.3.4 转化菌株的获得48
• 4.4 讨论48-49
• 第五章 菌株YC-YH1利用Tat系统分泌MPH能力测定49-55
• 5.1 实验材料49
• 5.1.1 试剂与材料49
• 5.1.2 主要仪器49
• 5.2 实验方法49-50
• 5.2.1 菌株YC-YH1(sTorA-mpd)生长曲线测定49
• 5.2.2 毒死蜱标准曲线的制作49-50
• 5.2.3 降解毒死蜱能力测定50
• 5.2.4 酶活力测定50
• 5.2.5 蛋白含量测定50
• 5.3 结果与分析50-54
• 5.3.1 菌株YC-YH1(sTorA-mpd)生长曲线50-51
• 5.3.2 毒死蜱标准曲线51-52
• 5.3.3 解毒死蜱能力测定52-53
• 5.3.4 酶活力测定53
• 5.3.5 蛋白含量测定53-54
• 5.4 讨论54-55
• 第六章 结论55-56
• 6.1 研究结果55
• 6.2 创新点55
• 6.3 展望55-56
• 参考文献56-62
• 致谢62-63
• 作者简历63

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