基于文库固定化的瘦肉精适配子筛选及应用研究

发布时间：2017-10-11 04:04

  本文关键词：基于文库固定化的瘦肉精适配子筛选及应用研究

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【摘要】：盐酸克伦特罗,沙丁胺醇和莱克多巴胺三种瘦肉精是目前畜牧养殖中最为常见的非法添加物,位列我国动物药品禁用目录之首。近年来,由于非法添加瘦肉精而引起突发中毒事件频发,给社会稳定和人类健康带来严重危害。因此构建快速、灵敏的分析方法应用于盐酸克伦特罗,沙丁胺醇和莱克多巴胺的现场检测具有重大意义。本研究通过采用文库固定化SELEX技术同时筛选制备盐酸克伦特罗,沙丁胺醇和莱克多巴胺三种瘦肉精的适配子。文库固定化筛选成本低,操作简单,同时消除了固定靶标空间位阻的影响,能够实现多个靶标适配子的同时筛选。通过该方法筛选的三种瘦肉精的适配子可作为新型的识别探针应用于现场检测中。主要筛选应用过程如下:首先,基于文库固定化SELEX筛选盐酸克伦特罗,沙丁胺醇和莱克多巴胺的适配子。设计一段与文库引物区互补配对的生物素化互补链P1(Biotin-P1),并与单链DNA(ss DNA)文库杂交互补,再将ss DNA文库通过Biotin-P1固定在亲和素包被的磁珠上。固定化文库与靶标盐酸克伦特罗,沙丁胺醇和莱克多巴胺孵育,固定的ss DNA结合靶标时构象发生改变,导致ss DNA与Biotin-P1分离并磁珠上脱落至溶液中,再通过磁分离获得结合靶标的ss DNA。经过反复的文库固定,孵育,分离,洗脱,PCR,酶切和纯化,在16轮正筛和7次反筛后富集了与盐酸克伦特罗,沙丁胺醇和莱克多巴胺特异性结合的适配子。其次,适配子亲和性和特异性验证。克隆测序后,针对三种靶标各获得40条序列。通过分析序列的同源性和二级结构挑选盐酸克伦特罗候选适配子序列8条,沙丁胺醇候选适配子序列10条和莱克多巴胺候选适配子序列9条进行FAM标记合成用于验证。经过验证后获得一条能同时识别盐酸克伦特罗和沙丁胺醇的适配子Apt-3序列,结合解离常数(Kd)分别为38.45±7.01 nmol/L和47.00±6.42 nmol/L,一条能特异性识别盐酸克伦特罗的适配子CLB-2,Kd值为76.61±12.70 nmol/L,一条能特异性识别沙丁胺醇的适配子SAL-5,Kd值为53.60±11.81 nmol/L和一条能够特异性识别莱克多巴胺的适配子RAC-6,Kd值为54.22±8.02 nmol/L。最后,构建基于适配子识别盐酸克伦特罗,沙丁胺醇和莱克多巴胺的荧光分析法。基于适配子CLB-2特异性识别盐酸克伦特罗,在浓度0.10-50.00 ng/m L范围内相对荧光强度与盐酸克伦特罗浓度间线性良好(R2=0.9905),检测限为0.08 ng/m L。基于适配子SAL-5特异性识别检测沙丁胺醇,在0.50-100.00 ng/m L范围内相对荧光强度与沙丁胺醇浓度间线性良好(R2=0.9966),检测限为0.12 ng/m L。基于适配子RAC-6特异性识别莱克多巴胺,在0.10-100.00 ng/m L范围内相对荧光强度与莱克多巴胺浓度间线性良好(R2=0.9925),检测限为0.04 ng/m L。同时该方法可用于实际猪肉样品的检测,回收率范围为84.50%-110.50%。
【关键词】：盐酸克伦特罗 沙丁胺醇 莱克多巴胺 适配子 SELEX
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.3;TS207
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 1 前言7-17
• 1.1 瘦肉精概述7
• 1.2 瘦肉精检测方法7-10
• 1.2.1 色谱分析法8
• 1.2.2 免疫学方法8-10
• 1.3 适配子10-12
• 1.3.1 适配子概述10
• 1.3.2 适配子应用10-12
• 1.4 SELEX筛选技术12-16
• 1.4.1 SELEX技术概述12-13
• 1.4.2 基于固定靶标的SELEX技术13
• 1.4.3 基于游离靶标的SELEX技术13-16
• 1.5 本课题的立题意义及研究内容16-17
• 2 实验材料与方法17-24
• 2.1 主要试剂17
• 2.2 主要仪器17
• 2.3 随机ssDNA文库和引物的构建17-18
• 2.4 Fe_3O_4磁性纳米颗粒制备与修饰18
• 2.4.1 氨基化Fe_3O_4磁性纳米颗粒制备与表征18
• 2.4.2 亲和素包被氨基化磁珠18
• 2.5 体外筛选三种瘦肉精的适配子18-21
• 2.5.1 文库固定化SELEX筛选流程18-19
• 2.5.2 文库固定与孵育19
• 2.5.3 PCR扩增19-20
• 2.5.4 单链的制备和纯化20
• 2.5.5 循环筛选20-21
• 2.5.6 克隆测序及序列分析21
• 2.6 适配子亲和性和特异性验证21-23
• 2.6.1 亲和性和特异性验证原理21-22
• 2.6.2 氧化石墨烯吸附条件优化22
• 2.6.3 适配子亲和性验证22
• 2.6.4 适配子特异性验证22-23
• 2.7 荧光分析法检测瘦肉精23-24
• 3 结果与讨论24-42
• 3.1 氨基化磁珠合成及修饰24-25
• 3.1.1 氨基化磁珠表征24
• 3.1.2 亲和素包被磁珠24-25
• 3.2 三种瘦肉精的适配子筛选25-28
• 3.2.1 ssDNA文库固定25
• 3.2.2 PCR退火温度的优化25-26
• 3.2.3 PCR扩增26-28
• 3.3 适配子序列分析28-30
• 3.3.1 盐酸克伦特罗适配子序列分析28-29
• 3.3.2 沙丁胺醇适配子序列分析29-30
• 3.3.3 莱克多巴胺适配子序列分析30
• 3.4 适配子亲和性验证30-35
• 3.4.1 氧化石墨烯用量优化30-31
• 3.4.2 氧化石墨烯吸附靶标验证31-32
• 3.4.3 盐酸克伦特罗适配子亲和性验证32-33
• 3.4.4 沙丁胺醇适配子亲和性验证33-34
• 3.4.5 莱克多巴胺适配子亲和性验证34-35
• 3.5 适配子特异性验证35-37
• 3.5.1 盐酸克伦特罗适配子特异性验证35-36
• 3.5.2 沙丁胺醇适配子特异性验证36-37
• 3.5.3 莱克多巴胺适配子特异性验证37
• 3.6 适配子结构分析37-38
• 3.7 基于适配子识别的荧光分析检测38-42
• 3.7.1 荧光分析法检测盐酸克伦特罗38-39
• 3.7.2 荧光分析法检测沙丁胺醇39-40
• 3.7.3 荧光分析法检测莱克多巴胺40-42
• 主要结论与展望42-44
• 主要结论42
• 展望42-44
• 致谢44-45
• 参考文献45-52
• 附录一：作者在攻读硕士学位期间发表的论文52-53
• 附录二：序列表53-58

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本文编号：1010352