两种新型β-受体激动剂溴布特罗和西布特罗酶免疫分析法的建立

发布时间：2017-10-14 17:33

  本文关键词：两种新型β-受体激动剂溴布特罗和西布特罗酶免疫分析法的建立

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【摘要】：β-受体激动剂也就是人们常说的瘦肉精,这类物质具有营养再分配的作用,能有效提高动物体的瘦肉率,常被用于畜牧业生产,并通过食物链危害人们的身体健康。在畜产品中残留而引发的食物中毒事件见诸报端,中华人民共和国农业部已多次颁布公告,明确提出禁止在动物饲料及其饮用水中添加β-激动剂。目前,最常使用的β-激动剂主要有盐酸克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇,近几年也出现了一种新的β-激动剂苯乙醇胺A,这几种瘦肉精都已具备了相应的检测方法。然而,作为新型瘦肉精的溴布特罗和西布特罗,其结构与克伦特罗相似,但测定方法有限。为对今后可能存在的瘦肉精类食品安全问题加以防范,建立溴布特罗和西布特罗的快速测定方法很有必要。本研究考虑到溴布特罗和西布特罗的结构十分相近,苯环上都带有氨基,因而均采用重氮化法合成溴布特罗与西布特罗的包被抗原及免疫原,最终得到溴布特罗和西布特罗两种多克隆抗体,分别建立了灵敏度高、特异性强的酶联免疫吸附分析(ic-ELISAs)法,同时通过高效液相色谱(HPLC)法印证了该法测定实际样品的可行性。在最优实验条件下,基于溴布特罗抗体的ELISAs法的IC50值在0.165-0.243ng·m L-1之间,基于西布特罗抗体的ELISAs法的IC50值为0.218 ng·mL-1,表明本研究所建立的酶联免疫吸附分析法灵敏度高。同时该方法的交叉反应实验表明了其较高的特异性。本研究选择猪肉、猪肝和猪饲料这三种实际样品进行加标回收测定,考察方法的准确性和精密度,其中,测定溴布特罗的回收率为91.9 115.4%,批内变异系数(CV)为1.5 9.5%(n=3),批间CV为1.7 13.4%(n=3);测定西布特罗的回收率在95.41 114.5%,批内CV为2.2 9.3%(n=3),批间CV为2.3 12.3%(n=3)。与HPLC的测定结果相比,基于溴布特罗和西布特罗的两种ELISA方法均与HPLC有着很好的相关性。此外,针对西布特罗酶免疫分析方法,本研究还选取了基于金纳米颗粒的免疫层析试剂条作为方法对照,半定量试剂条的最低检测限在3 ng·m L-1,该灵敏度远远不如ELISA法。因此,经过实验证实,本论文建立的ELISA法是一种可靠的测定饲料及组织样品中溴布特罗和西布特罗的方法,且具有灵敏度高、特异性强的优点。
【关键词】：酶联免疫吸附分析法 β-受体激动剂 溴布特罗 西布特罗 多克隆抗体 食品安全
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 绪论12-34
• 1.1 引言12
• 1.2 β-激动剂概述12-15
• 1.2.1 β-激动剂简介12-14
• 1.2.2 β-激动剂作用机理14-15
• 1.2.3 β-激动剂的检测现状15
• 1.3 酶联免疫吸附分析法（ELISA）15-33
• 1.3.1 引言15-16
• 1.3.2 抗原16-20
• 1.3.2.1 抗原的定义16
• 1.3.2.2 抗原的特异性和交叉反应16
• 1.3.2.3 半抗原的修饰原则16-17
• 1.3.2.4 半抗原的修饰方法17-18
• 1.3.2.5 完全人工抗原的合成18-20
• 1.3.2.6 完全人工抗原的纯化和鉴定20
• 1.3.3 抗体20-23
• 1.3.3.1 抗体的定义和类型20
• 1.3.3.2 抗体的制备20-21
• 1.3.3.3 抗体的纯化21-23
• 1.3.4 抗原-抗体反应23-24
• 1.3.4.1 抗原-抗体反应的原理[17]23
• 1.3.4.2 抗原-抗体反应的特点23-24
• 1.3.4.3 抗原-抗体反应的影响因素24
• 1.3.5 免疫分析24-25
• 1.3.6 酶联免疫吸附分析法（ELISA）25-30
• 1.3.6.1 ELISA的概念及原理[49]25
• 1.3.6.2 ELISA的分类25-27
• 1.3.6.3 ELISA的特点27
• 1.3.6.4 ELISA的应用27
• 1.3.6.5 ELISA的进展27-30
• 1.3.7 胶体金免疫层析（GICA）技术简介30-33
• 1.3.7.1 GICA的概念与原理30
• 1.3.7.2 GICA的特点30-31
• 1.3.7.3 GICA的分类31-33
• 1.3.7.4 GICA的应用33
• 1.4 本研究的目的和意义33-34
• 第二章 溴布特罗酶联免疫吸附分析法的建立34-53
• 2.1 引言34
• 2.2 实验材料34-36
• 2.2.1 实验试剂34-35
• 2.2.2 溶液配制35-36
• 2.2.3 实验仪器和设备36
• 2.2.4 实验动物36
• 2.3 免疫原、包被抗原的制备36-37
• 2.4 多克隆抗体的制备37-38
• 2.4.1 首次免疫37
• 2.4.2 加强免疫37
• 2.4.3 抗血清的监测37-38
• 2.4.4 抗血清的收集38
• 2.5 间接竞争酶联免疫吸附分析法的建立38-42
• 2.5.1 间接竞争酶联免疫吸附分析方法38-39
• 2.5.2 ELISA实验条件的优化39
• 2.5.3 交叉反应39-41
• 2.5.4 样品的加标回收实验41
• 2.5.5 ELISA与HPLC的对照实验41-42
• 2.6 结果与讨论42-52
• 2.6.1 免疫原与包被抗原的鉴定42-43
• 2.6.2 多克隆抗体的验证和监测43-45
• 2.6.3 ELISA实验条件的优化以及方法的灵敏度与稳定性45-46
• 2.6.4 ELISA方法的特异性46-47
• 2.6.5 样品的加标回收实验47-49
• 2.6.6 ELISA与HPLC的相关性49-52
• 2.7 本章小结52-53
• 第三章 西布特罗酶联免疫吸附分析法的建立53-74
• 3.1 引言53
• 3.2 实验材料53-56
• 3.2.1 实验试剂53-55
• 3.2.2 实验仪器和设备55-56
• 3.2.3 溶液配制56
• 3.2.4 实验动物56
• 3.3 免疫原、包被抗原的制备56-57
• 3.4 多克隆抗体的制备57-58
• 3.4.1 首次免疫57
• 3.4.2 加强免疫57-58
• 3.4.3 抗血清的监测58
• 3.4.4 抗血清的收集58
• 3.5 间接竞争酶联免疫吸附分析法的建立58-62
• 3.5.1 间接竞争酶联免疫吸附分析方法58-59
• 3.5.2 ELISA实验条件的优化59
• 3.5.3 交叉反应59-61
• 3.5.4 样品的加标回收实验61
• 3.5.5 ELISA与HPLC的对照实验61-62
• 3.6 免疫层析分析方法的探讨62-63
• 3.6.1 抗体的纯化62
• 3.6.2 AuNPs-Ab复合物的制备62
• 3.6.3 免疫层析试剂条的制备62-63
• 3.6.4 基于AuNPs的免疫层析过程63
• 3.7 结果与讨论63-73
• 3.7.1 免疫原与包被抗原的鉴定63-64
• 3.7.2 多克隆抗体的验证和监测64-65
• 3.7.3 ELISA实验条件的优化以及方法的灵敏度与稳定性65-67
• 3.7.4 ELISA方法的特异性67-68
• 3.7.5 样品的加标回收实验68-69
• 3.7.6 ELISA与HPLC的相关性69-72
• 3.7.7 AuNPs的表征与免疫层析试剂条抑制信号的考察72-73
• 3.8 本章小结73-74
• 总结74-75
• 参考文献75-80
• 攻读硕士学位期间发表的论文80-81
• 致谢81-82

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