基于DNA杂交链反应放大策略的DNA甲基化转移酶活性及羟甲基化程度电化学分析
本文关键词：基于DNA杂交链反应放大策略的DNA甲基化转移酶活性及羟甲基化程度电化学分析
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【摘要】：DNA甲基化是目前研究最多的DNA表观遗传修饰之一。DNA甲基化由DNA甲基转化移酶催化完成的。由于DNA甲基化状态是可被逆转的,也就是存在DNA去甲基化过程,但相对于甲基化过程,去甲基化过程更加复杂。DNA的甲基化与去甲基化这两个过程相互平衡,维持了DNA甲基化模式的稳定。大量研究表明,许多重要的过程如胚胎发育和细胞周期调控都与甲基化息息相关,而多个癌症也表现出异常的甲基化模式。因此,发展简易、灵敏、准确、可靠的用于定位、定量分析DNA甲基化的方法是至关重要的。相对于其他方法,电化学拥有如检测时间短、操作简单、费用低、易于小型化等诸多优势,是一种具有良好发展前景的分析测试方法。本论文旨在建立某些疾病DNA的电化学、去甲基化程度的电化学检测方法,为某些疾病的临床诊断和治疗观察提供准确、快速和灵敏的方法。本论文的主要工作是通过DNA杂交链反应,实现DNA甲基化、去甲基化状态及DNA甲基化转移酶的电化学信号放大检测。1.DNA甲基化转移酶(MTase)活性与肿瘤发生,发展密切相关。本文建立了免标记超结构电化学方法用于信号放大检测DNA甲基转移酶活性(例如使用M.SssI甲基化转移酶)。控制固定在金电极上低密度的DNA有利于形成DNA超结构,从而有效地实现信号放大。以RuHex作为电化学信号分子,可以静电吸附到双链DNA上,实现了免标记的电化学检测。实验证明,使用差分脉冲伏安法(DPV)能够有效的检测DNA甲基化转移酶的活性,线性范围为0.5-120U/mL,信噪比为3时,检出限为0.025 U/mL。此外,在细胞裂解液内依然可以检测甲基化转移酶的活性。同时,本文也证实了该方法应用于快速估测和筛选甲基化转移酶抑制剂,它可以有助于探索与甲基化相关的抗癌药物。2.DNA去甲基化过程是DNA甲基化的可逆过程,研究发现,5-甲基胞嘧啶(5mC)在TET酶的催化氧化作用下生成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC),5hmC的发现为DNA去甲基化研究提供了新的思路。且5hmC在体细胞重编程,胚胎发育和启动哺乳动物DNA去甲基化中有重要作用。因此检测DNA样品中5hmC的含量是十分必要的。在本文中,我们建立了基于DNA杂交链反应(HCR)信号扩增电化学方法用来有效的量化DNA羟甲基化程度。当DNA序列中羟基化的胞嘧啶在UDP-glucose存在下被T4-βGT作用形成5ghmC,并阻碍MspJI识别剪切,经辅助DNA (FcA-S3S4)杂交作用后,与吸附到DNA链上的RuHex形成电子转移通道,使信号放大。(I2-I0/I1-I0)代表双链DNA羟基化比例,实验证明,当羟甲基化DNA的比例在1%到90%范围内,(I2-I0/I1-I0)呈线性关系,线性相关系数是0.9967,信噪比为3时,估算最低检测限是0.05%。该方法因其灵敏度高和响应速度快。
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q523;O657.1
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，本文编号：1180051
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