基于磁性纳米粒子及温敏性水凝胶的蛋白质印迹技术研究与应用

发布时间：2017-03-17 20:04

  本文关键词：基于磁性纳米粒子及温敏性水凝胶的蛋白质印迹技术研究与应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：蛋白质组是指一个基因组或一个细胞、组织表达的所有蛋白质。蛋白质组学是在蛋白质水平上定量、动态、整体性地研究生物体。其主要研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达、翻译、修饰、构象及蛋白质间相互作用等。蛋白质组学的研究是探索生命奥秘的必须，也能为了人类的健康事业作出贡献。随着蛋白质组学研究的日益进展，蛋白质的分离、富集及快速检测等问题受到了极大的关注。目前分子印迹是一种成熟的小分子化合物的分离分析方法，合成的分子印迹聚合物具有三大特征：结构预定性、特异识别性及广泛适用性。随着蛋白质组学研究的不断深入，近年来分子印迹技术在蛋白质组学研究中也取得了一定的进展，其主要着力于蛋白质的纯化、分离和富集。 本研究以蛋白质为研究对象，将分子印迹技术分别与磁性纳米材料和温敏性材料结合，合成出具有特异性识别和高吸附量的蛋白质印迹聚合物。主要研究内容如下： (1)二氧化硅表面修饰的磁性Fe_3O_4纳米粒子合成与表征 采用改进的共沉淀法制备出了平均直径为60nm左右的磁性Fe_3O_4纳米粒子，在其合成过程中加入了水合肼充当了除氧剂、沉淀剂和还原剂，通过四乙氧基硅烷（TEOS）的水解在Fe_3O_4纳米粒子表面修饰上二氧化硅，获得粒径大小约为840nm的硅烷化Fe_3O_4粒子。实验结果表明：二氧化硅成功包覆到磁性Fe_3O_4粒子表面，，其质量损失约为7%左右；磁性Fe_3O_4纳米粒子粒径约为60nm，表面修饰前后粒子的方晶型结构没有改变，修饰后的磁性粒子的分散性和稳定性均得到提高，其饱和磁化强度高达10.25emu/g，与磁性Fe_3O_4纳米粒子的38.16emu/g相比略有降低，但仍具有较好的磁性行为。 (2)磁性聚多巴胺分子印迹聚合物的合成及对牛血红蛋白的识别和分离 将分子印迹技术与磁性纳米材料相结合，以硅烷化的Fe_3O_4粒子作为磁性核，通过多巴胺自聚在其表面形成一层“壳”，合成核壳型的牛血红蛋白磁性分子印迹纳米粒子（MIP）。聚多巴胺包覆在硅烷化Fe_3O_4粒子表面，可避免了载体阻碍蛋白质扩散的现象。实验结果表明：聚多巴胺印迹壳层上具有特异性识别位点，其对模板蛋白有较高的选择性(β=2.19)和稳定性，并且能使目标蛋白在较短的时间内扩散到印迹位点达到吸附平衡。同时MIP对目标蛋白还有较高的吸附量（4.65±0.38mg/g），可重复利用三次以上。在外加磁场的作用下，MIP本身的饱和磁化强度(10.33emu/g)对磁场敏感，能快速地从反应介质中分离出来。这些结果证明了磁性分子印迹纳米粒子可应用于生物大分子的分离，特别是蛋白质组学中高丰度蛋白的去除。 (3) N马来酰化壳聚糖交联温敏性分子印迹水凝胶识别牛血清蛋白 利用壳聚糖与马来酸酐的酰化反应，合成了水溶性的N马来酰化壳聚糖（N maley chitosan, N MACH），因其含有羧基、氨基和双键，可作为蛋白质印迹中的交联剂。以牛血清白蛋白（BSA）为模板蛋白，N异丙基丙烯酰胺（NIPAM）、丙烯酰胺（AAm）作为功能单体、N马来酰化壳聚糖作为交联剂，在水溶液中自由聚合形成温敏性印迹水凝胶，其最低临界溶解温度在34℃左右。温敏性印迹水凝胶的吸附容量高达5.72mg/g，是非印迹水凝胶的4.8倍，其吸附过程符合Langmuir吸附模型，分离因子为4，对模板蛋白具有特异选择性。本研究为蛋白质印迹提供了一种新的水溶性交联剂：N马来酰化壳聚糖，其具有优良的水溶性、生物降解性，是一种环境友好型的交联剂。因此将其作为交联剂合成出的印迹水凝胶在蛋白质的分离和富集方面具有很好的应用前景。
【关键词】：分子印迹技术 磁性纳米粒子 表面修饰 蛋白质分离 智能水凝胶 温敏性 聚N异丙基丙烯酰胺 N马来酰化壳聚糖交联剂
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：O631.3;O629.73
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第1章 绪论13-27
• 1.1 蛋白质印迹技术13-19
• 1.1.1 分子印迹简介13
• 1.1.2 蛋白质的基本性质13-14
• 1.1.3 蛋白质印迹的特点与难点14-15
• 1.1.4 蛋白质印迹研究的意义15-16
• 1.1.5 蛋白质印迹的原理16
• 1.1.6 蛋白质印迹聚合物的制备方法16-17
• 1.1.7 蛋白质印迹技术的应用17-18
• 1.1.8 问题与展望18-19
• 1.2 磁性纳米粒子19-22
• 1.2.1 磁性纳米粒子的概述19
• 1.2.2 磁性纳米粒子的合成19-20
• 1.2.3 磁性纳米粒子的表面改性20-21
• 1.2.4 磁性纳米粒子的应用21-22
• 1.2.5 问题与展望22
• 1.3 智能水凝胶22-25
• 1.3.1 智能水凝胶简介22
• 1.3.2 智能水凝胶的分类22-23
• 1.3.3 智能水凝胶的制备方法23-24
• 1.3.4 智能水凝胶的应用24
• 1.3.5 问题与展望24-25
• 1.4 课题意义与内容25-27
• 1.4.1 本课题的研究背景与研究意义25
• 1.4.2 本课题研究内容25-27
• 第2章 二氧化硅表面修饰的磁性 Fe_3O_4纳米粒子合成与表征27-34
• 2.1 引言27
• 2.2 实验部分27-29
• 2.2.1 实验仪器27-28
• 2.2.2 化学试剂28
• 2.2.3 磁性 Fe_3O_4纳米粒子的制备28
• 2.2.4 二氧化硅表面修饰磁性 Fe_3O_4纳米粒子28
• 2.2.5 样品表征28-29
• 2.3 结果与讨论29-32
• 2.3.1 磁性 Fe_3O_4制备及表面修饰29
• 2.3.2 X 射线衍射表征29-30
• 2.3.3 红外光谱表征30-31
• 2.3.4 扫描电镜表征31
• 2.3.5 磁学性能表征31-32
• 2.3.6 热重分析32
• 2.4 小结32-34
• 第3章 磁性聚多巴胺分子印迹聚合物的合成及对牛血红蛋白的识别和分离34-46
• 3.1 引言34-35
• 3.2 实验部分35-36
• 3.2.1 实验仪器35
• 3.2.2 化学试剂35
• 3.2.3 磁性牛血红蛋白分子印迹纳米粒子的制备35-36
• 3.2.4 蛋白质吸附实验36
• 3.3 结果与讨论36-45
• 3.3.1 磁性牛血红蛋白分子印迹纳米粒子的合成36-37
• 3.3.2 合成粒子的表征37-40
• 3.3.3 吸附动力学40-42
• 3.3.4 平衡结合实验42-43
• 3.3.5 特异性选择实验43-44
• 3.3.6 重复利用实验44-45
• 3.4 小结45-46
• 第4章 N 马来酰化壳聚糖交联温敏性分子印迹水凝胶识别牛血清蛋白46-58
• 4.1 引言46-47
• 4.2 实验部分47-49
• 4.2.1 仪器与试剂47
• 4.2.2 N 马来酰化壳聚糖交联剂的制备47
• 4.2.3 印迹水凝胶的制备47-48
• 4.2.4 水凝胶的表征48
• 4.2.5 水凝胶温敏性的测定48
• 4.2.6 蛋白质吸附实验48-49
• 4.3 结果与讨论49-56
• 4.3.1 N 马来酰化壳聚糖交联剂的合成49-50
• 4.3.2 印迹水凝胶的合成50-52
• 4.3.3 水凝胶的表征52
• 4.3.4 水凝胶温敏性的测定52-53
• 4.3.5 蛋白质吸附动力学53-54
• 4.3.6 蛋白质吸附热力学54-55
• 4.3.7 吸附选择性55-56
• 4.4 小结56-58
• 结论与展望58-61
• 参考文献61-69
• 附录 A 攻读学位期间所发表的学术论文目录69-70
• 致谢70

【参考文献】

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本文编号：253369