限域空间内固定化酶的界面活化及催化非专一性底物合成4H-吡喃药物中间体

发布时间：2020-03-27 00:49

【摘要】：酶作为一种高效的生物催化剂,具有高效性、强专一性等特点,许多难以进行的有机反应在酶的催化下都能顺利完成。然而,对于非专一性底物,酶催化往往无法实现其高效转化。因此,如何调控酶结构强化其对非专一底物的催化转化是近些年来生物化学以及催化化学等领域的研究热点。本论文利用介孔二氧化硅材料构筑固定化酶催化剂,利用限域空间内固定化酶的界面活性效应强化其对非专一性底物的催化活性。通过调控介孔二氧化硅的几何微环境(孔道形状、孔道尺寸)以及化学微环境(表面亲疏水性),深入研究限域空间内固定化酶的界面活化效应。主要研究工作如下:1、利用具有二维六方孔道结构的介孔SBA-15以及三维笼状孔道结构的介孔MCF作为载体,控制孔道尺寸相近的条件下(～11 nm),构筑固定化黑曲霉脂肪酶催化剂SBA-15-ANL与MCF-11-ANL,关联限域空间的孔道形状与反应活性。在催化非专一性底物对氟苯亚甲基丙二腈合成4-H吡喃类药物的反应中,固定化酶SBA-15-ANL(174.6 U g-1)与MCF-11-ANL(246.9 Ug-1)均得到了高于游离酶(64.2 Ug-1)的活性。利用荧光光谱和衰减全反射(ATR)-FTIR研究三级结构和二级结构,结果表明不同孔道形状载体对酶界面活化作用,界面活化作用依赖于限域效应,三维笼状MCF-11可以为酶提供更强的界面活化效应;2、利用具有三维笼状孔道结构的介孔SBA-16和MCF作为载体,构筑固定化黑曲霉脂肪酶催化剂,调控限域空间的孔道尺寸(8、11、23、31 nm),关联限域空间的孔道尺寸与反应活性,深入研究限域空间内固定化酶的界面活化效应。在催化非专一性底物对氟苯亚甲基丙二腈合成4-H吡喃类药物的反应中,反应活性随着孔径增加存在最优值,当孔道尺寸为11nm时,MCF-11-ANL催化活性高达246.9Ug-1。荧光光谱研究表明活性依赖于三维结构Trp微环境的极性,ATR-FTIR研究表明α-螺旋含量的增加量和β-转角含量的减少量依赖于孔道尺寸,并给出了可能的活性位点氨基酸相对位置的变化情况以及对底物在活性中心的结合方式;3、利用具有三维笼状介孔二氧化硅MCF表面羟基的可修饰性,分别对其表面进行后接枝修饰不同链长的疏水烷基,构筑了不同疏水性质的化学微环境,用于催化非专一性底物对氟苯亚甲基丙二腈合成4-H吡喃类药物的反应中,与未改性载体MCF-23(173.3 Ug-1)的活性相比,甲基改性的微环境MCF-23-CH3-ANL的活性最优(233.7 U g-1),但随着疏水链的增长,活性会有一定程度的降低(121.9、92.2、54.8、33.5 Ug-1),表明随着疏水性进一步增太强活性降低;利用荧光光谱和ATR-FTIR研究三级结构和二级结构,结果表明界面活化作用随着载体表面疏水性增加增强,疏水改性更有利于酶二级结构的保持;4、进一步研究组装催化剂MCF-23-ANL的重复使用性能,重复使用性研究表明使用5次后MCF-23-ANL仍然能保持72%的初始活性;底物普适性研究表明,MCF-23-ANL还可催化对硝基苯亚甲基丙二腈、对氯苯亚甲基丙二腈、苯亚甲基丙二腈、对羟基苯亚甲基丙二腈底物的反应,对带有吸电子取代基的底物具有更好的反应活性。
【图文】：

＝５％）作为溶剂，如表１－１邋（ｅｎｔｒｙ邋４）所示，使用ＰＰＬ水解酶催化２－丁酮和４－硝基苯甲逡逑醛不对称加成反应，获得高达４６．９邋％的产率。逡逑此外，他们对水解酶催化非专一性底物的机制进行了推断［２５］。如图１－３所示，首逡逑先，丙酮首先被Ａｓｐ－Ｈｉｓ残基组成的二元催化中心和氧阴离子洞稳定；随后，Ｈｉｓ残逡逑基从丙酮捕获质子并形成一个烯醇离子，随后，烯醇离子和另一活化底物醛发生亲核逡逑加成，形成碳－碳键，最终产物从氧离子洞释放出来。逡逑Ｈｉｓ逦Ｈｉｓ逦Ｈｉｓ逡逑ＨｉＳ＼逦－逦Ｏ邋ＡｓＰ＼邋ｒｉ邋／＝＼逦Ａｓｐｖ邋－逡逑、。力丫邋Ｈ？＇ｈ邋４卜么—卜逡逑Ｏｘｖａｎｉｏｎｈｏｌｃ邋Ｈ邋°＾Ｈ逦／Ｈ邋Ｈ邋Ｈ．逦Ｏｘｖａｎｉｏｎ邋ｈｏｌｅ邋Ｈ邋Ｈ逡逑＇？邋＼逦Ｉ逦Ｉ邋＼逡逑图１－３脂肪酶催化Ａｌｄｏｌ加成反应可能的机理ｔ２５】逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｔｈｅ邋ｐｏｓｓｉｂｌｅ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｏｆ邋Ａｌｄｏｌ邋ａｄｄｉｔｉｏｎ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｃａｔａｌｙｚｅｄ邋ｂｙ邋ｌｉｐａｓｅ逡逑１．２．１．２邋Ｍｉｃｈａｅｌ邋ａｄｄｉｔｉｏｎｓ邋反应逡逑Ｍｉｃｈａｅｌ加成的典型代表是亲核试剂１．４－共轭加成在ｃｔ，ｐ－不饱和羰基化合物的反逡逑应ｔ２６，２＇是通过１，４－加成形成新Ｃ－Ｃ键的最基础和最有用的方法之一，近几年来在合逡逑成中通过生物蛋白酶催化Ｍｉｃｈａｅｌ加成引起了科学家门的研究兴趣。早在八十年代，逡逑Ｋｉｔａｚｕｍｅ等指出水解酶在缓冲液中具有催化硫醇和胺与不饱和羰基化合物迈克尔逡逑加成的能力，然而，只有在过去十年，更多关于酶迈克尔加成的报道才开始出现［２９，３１，逡逑３１］

（３－不饱和醛和酮等，作为受体与１，３－二羰基化合物或环己嗣反应产率高达逡逑８５邋％。２０１２年，何等Ｗ发现４－羟基香豆素与ａ，ｐ不饱和烯酮之间的反应，用于制备一逡逑种有效的抗凝血剂华法林及其衍生物，如图１－４邋ｂ所示，这是第一个生物催化剂用于逡逑制备华法林及其衍生物的例子。研究表明ＰＰＬ不仅可以催化不对称ａｌｄｏ丨反应，也可逡逑以催化Ｍｉｃｈａｅｌ加成反应。通过系统地研究ＰＰＬ催化的迈克尔华法林合成参数的影响逡逑得到中等到产率（高达９５邋％）和一定对映选择性丨ｅｅ值高达２８邋％）。脂肪酶均被用于逡逑催化迈克尔加成，只有个别脂肪酶产率高达９５％，大多数酶的产率较低，但是依然取逡逑得了很大的成果。逡逑0邋0逡逑Ｑ＾Ｎ0Ｊ邋＋邋Ｘａｏｅ，逡逑ｏ逡逑＾逦Ｎ0逦９逦９逦■逦ＬｔＯ邋－邋ＯＫＩ逡逑２邋＋邋Ｋｔ0＾0Ｅｔ逡逑ｏ邋ｏ逡逑0邋（）逦Ｅｔ（）人邋ｒ邋0Ｅｔ逡逑ｉ邋ｔｏ邋ｆ邋Ｏｕｔ逡逑Ｂｒｉｙ０２邋＋逦＾邋0ｉ＾Ｎ0２逡逑ＯＨ逦ＯＨ邋Ｒ邋Ｏ逡逑ＱＣ＾ＸＨ邋＋邋Ｒ、人邋ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｇ．Ｉ４４，ｈ逡逑图１－４脂肪酶催化的（ａ）丨，３－二羰基化合物和酮的Ｍｉｃｈａｅ丨加成反应及（ｂ）邋４－羟基香豆素与ａ，ｐ不饱逡逑和烯酮的Ｍｉｃｈａｅｌ加成反应逡逑Ｆｉｇ．邋１－４邋（ａ）邋Ｍｉｃｈａｅｌ邋ａｄｄｉｔｉｏｎ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｙｐｅｓ邋ｏｆ邋１，３－ｄｉｃａｒｂｏｎｙｌ邋ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ邋ａｎｄ邋ｋｅｔｏｎｅ邋ａｎｄ邋（ｂ）逡逑Ｍｉｃｈａｅｌ邋ａｄｄｉｔｉｏｎ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋４－ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ邋ａｎｄ邋ａ
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O643.36;TQ460.4

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本文编号：2602201