基于Endo-M N175Q酶转糖基活性的N-糖链分析
发布时间：2020-04-10 09:03
【摘要】：近年来,以质谱为分析平台的糖链分析研究取得了很大程度进展。糖链的释放和衍生化等样品制备方法不断得到丰富和改进,糖链的各种分析策略相继建立起来,本文主要对糖链的定性分析方法做分析和总结。本论文采用化学酶标记法,酶标记是糖基化分析的最有前途的方法之一,因为其简单:标记发生在酶消化过程中,可以避免额外的试剂,额外的步骤和副反应。化学酶法因其温和的反应条件、高度的空间区域选择性,避免了化学合成繁琐的保护步骤而成为研究的热点,为研究糖蛋白中的N-糖链,提供了新的思路。第一章绪论的主要内容是糖蛋白糖链现状以及与疾病有哪些关联,并且详细说明糖蛋白的组成结构和应用。目前研究糖链的方法多用PNGaseF酶,但本文使用了胰蛋白酶,所以绪论部分对此进行了简短介绍和说明,同时对最后一步转糖基酶Endo-MN175Q的作用及优点做出详尽解释。第二章实验部分,着重说明实验所需各种溶液的配制,以及实验过程中涉及的脱盐,胰蛋白酶切,丙酮富集糖肽,酶反应条件及方法,并且通过最后优化的方法对三种标准品进行定性检测分析,结果较好。第三章结果与讨论中,着重探讨了三种糖蛋白分析方法,其中方法一是糖蛋白在Endo-MN175Q的作用下,直接将寡糖转移到受体上。方法二使用PNGase F酶对糖链进行分析,将寡糖转移到受体。而第三种方法是本文着重讨论的方法,用胰蛋白酶将糖蛋白酶切,对肽链进行丙酮富集,而现在大多数论文的一般方法都是对肽段进行分析,而本文方法具有新颖性,采用丙酮富集糖肽的方法,将寡糖转移至受体后与175Q酶反应,经过谱图检测后发现丙酮富集糖肽方法效果非常好,随后细致的探讨了各步骤反应条件优化情况,确定了最终方法。然后将此方法应用于三种标准糖蛋白,分别是牛胰核糖核酸酶B,卵清蛋白,胎球蛋白。其中着重突出了丙酮在-25度冰柜中,以及5倍体积量富集糖肽效果最好,检测到的糖肽链最多。通过糖链在丙酮和水中的溶解度不同,而形成清液和沉淀,接着对沉淀进行丙酮富集,得到丰富的糖链信息。最后用Endo-M的突变体175Q酶进行转移,效率高,结果好。以牛胰核糖核酸酶B共检测到5种糖链,分别是M5N2,M6N2,M7N2,M8N2,M9N2。卵清蛋白检测到5种,分别是M5N2,M6N2,M8N2,M3N4,M3N6。胎球蛋白检测到 6 种,分别是 M3N4G2,M3N4G2Ac2,M3N4G2Ac3,M3N5G3Ac,M3N5G3Ac2,M3N6G4Ac4。本文建立高效、高选择性的丙酮富集糖肽方法,利用175Q酶转糖基反应特性,使用化学酶衍生化法对糖蛋白进行定性定量分析。
【图文】：
加５ｍＵＥｎｄｏ－Ｍ－Ｎ１７５Ｑ酶５队，在金属浴３２°Ｃ条件下反应３小时，反应结束后加逡逑１０队乙腈使酶失活，总体积为４０邋ｎＬ，进ＬＣ－ＭＳ液质检测分析。逡逑＿果如图７所示。逦逡逑ｘｌＯ７邋＊ＳＳｌ邋ＴＩＣ逦Ｆｒａｇ－１３Ｓ．０Ｖ邋６６９．ｄ逡逑６－邋｜逡逑，｜邋Ａ－ＴＩＣ逡逑３－逦｜逡逑２．逦ｉ邋ｊ，逡逑０－１逦逦逦逦逦逦逦逦逦逦逦逦逦逦逦逦邋逦逦，逦逦逦ｖ邋＂Ａ…N：二一工：－二、．“…丫．…｝．二；：二＂．．…．．．．．．．．．．．．．；Ｙ，………，…．…｜．．．．．．．＞．．，，ｖ．．ｒ．；．．，，ｖ．；，Ｔｒ（逡逑１５邋Ｉ６邋１？邋１８邋１９邋２０邋２１邋２２邋２３邋２４邋ｉｆ）邋２６邋２：邋＾邋２９邋３０邋３１邋３２邋＾邋＾邋３６邋３６邋３７邋３８邋３９邋４０邋４邋１邋４２邋４邋３邋４４逡逑Ｃｍ＼ｔｓ邋ｖｓ．邋ｆ邋ｊｆｅｆｆｔｆｏ］邋（．ｉｎ）逡逑１２逡逑
图９表示牛胰核糖核酸酶Ｂ经过ＤＴＴ－ＩＡＡ变性处理后，直接与１７５Ｑ酶反应，谱图结逡逑果虽比热变性清晰，但仍然只能检测到两种糖链，Ｍ５Ｎ２和Ｍ６Ｎ２。Ｃ－丨是Ｍ５Ｎ２的色谱逡逑图ＥＩＣ，邋Ｃ－２是萃取后Ｍ５Ｎ２的质谱图ＥＳＩ，邋Ｄ＿１是Ｍ６Ｎ２的色谱图ＥＩＣ，邋Ｄ－２是Ｍ６Ｎ２萃逡逑取后的质谱图ＥＳＩ。Ｍ６Ｎ２峰不是单独尖峰，不是很清晰，需要放大后才可以找到相应分逡逑子量。综合两种变性方法得到的ＬＣ－ＭＳ谱图，这种将糖蛋白变性后，不经任何处理直接逡逑与１７５Ｑ反应的方法有局限性，不能有效转移寡糖链。所以我们又继续进行了其他方法的逡逑尝试。逡逑３．邋４邋ＰＮＧａｓｅ邋Ｆ酶切对糖肋分析逡逑根据文献，一般方法基本是将糖蛋白变性，ＰＮＧａｓｅＦ酶切，纯化分离，与１７５Ｑ酶反逡逑应，所以我们根据论文对２种标准糖蛋白，牛胰核糖核酸酶Ｂ和胎球蛋白采用ＰＮＧａｓｅ邋Ｆ逡逑酶切，得到寡糖，对糖链分析。逡逑ＰＮＧａｓｅＦ酶使用条件也比较麻烦，ｐＨ邋＝邋７．５缓冲溶液条件，还需要同ＳＤＳ，邋ＮＰ－４０搭逡逑配使用，这样就会引起多余的杂质，引出杂质就要除去杂质，这个过程浪费时间，也会浪逡逑１７逡逑
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q55;O657.63
本文编号：2622031
【图文】：
加５ｍＵＥｎｄｏ－Ｍ－Ｎ１７５Ｑ酶５队，在金属浴３２°Ｃ条件下反应３小时，反应结束后加逡逑１０队乙腈使酶失活，总体积为４０邋ｎＬ，进ＬＣ－ＭＳ液质检测分析。逡逑＿果如图７所示。逦逡逑ｘｌＯ７邋＊ＳＳｌ邋ＴＩＣ逦Ｆｒａｇ－１３Ｓ．０Ｖ邋６６９．ｄ逡逑６－邋｜逡逑，｜邋Ａ－ＴＩＣ逡逑３－逦｜逡逑２．逦ｉ邋ｊ，逡逑０－１逦逦逦逦逦逦逦逦逦逦逦逦逦逦逦逦邋逦逦，逦逦逦ｖ邋＂Ａ…N：二一工：－二、．“…丫．…｝．二；：二＂．．…．．．．．．．．．．．．．；Ｙ，………，…．…｜．．．．．．．＞．．，，ｖ．．ｒ．；．．，，ｖ．；，Ｔｒ（逡逑１５邋Ｉ６邋１？邋１８邋１９邋２０邋２１邋２２邋２３邋２４邋ｉｆ）邋２６邋２：邋＾邋２９邋３０邋３１邋３２邋＾邋＾邋３６邋３６邋３７邋３８邋３９邋４０邋４邋１邋４２邋４邋３邋４４逡逑Ｃｍ＼ｔｓ邋ｖｓ．邋ｆ邋ｊｆｅｆｆｔｆｏ］邋（．ｉｎ）逡逑１２逡逑
图９表示牛胰核糖核酸酶Ｂ经过ＤＴＴ－ＩＡＡ变性处理后，直接与１７５Ｑ酶反应，谱图结逡逑果虽比热变性清晰，但仍然只能检测到两种糖链，Ｍ５Ｎ２和Ｍ６Ｎ２。Ｃ－丨是Ｍ５Ｎ２的色谱逡逑图ＥＩＣ，邋Ｃ－２是萃取后Ｍ５Ｎ２的质谱图ＥＳＩ，邋Ｄ＿１是Ｍ６Ｎ２的色谱图ＥＩＣ，邋Ｄ－２是Ｍ６Ｎ２萃逡逑取后的质谱图ＥＳＩ。Ｍ６Ｎ２峰不是单独尖峰，不是很清晰，需要放大后才可以找到相应分逡逑子量。综合两种变性方法得到的ＬＣ－ＭＳ谱图，这种将糖蛋白变性后，不经任何处理直接逡逑与１７５Ｑ反应的方法有局限性，不能有效转移寡糖链。所以我们又继续进行了其他方法的逡逑尝试。逡逑３．邋４邋ＰＮＧａｓｅ邋Ｆ酶切对糖肋分析逡逑根据文献，一般方法基本是将糖蛋白变性，ＰＮＧａｓｅＦ酶切，纯化分离，与１７５Ｑ酶反逡逑应，所以我们根据论文对２种标准糖蛋白，牛胰核糖核酸酶Ｂ和胎球蛋白采用ＰＮＧａｓｅ邋Ｆ逡逑酶切，得到寡糖，对糖链分析。逡逑ＰＮＧａｓｅＦ酶使用条件也比较麻烦，ｐＨ邋＝邋７．５缓冲溶液条件，还需要同ＳＤＳ，邋ＮＰ－４０搭逡逑配使用，这样就会引起多余的杂质，引出杂质就要除去杂质，这个过程浪费时间，也会浪逡逑１７逡逑
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q55;O657.63
【参考文献】
相关硕士学位论文 前1条
1 徐长帅;利用HPLC/ESI-MS建立糖蛋白中N-糖链的分析方法[D];延边大学;2016年
本文编号：2622031
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/huaxue/2622031.html
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