基于酵母CTP再生的唾液酸化寡糖合成

发布时间：2020-04-29 11:48

【摘要】：细胞表面的寡糖参与了细胞内一系列的生命活动进程,其中含有末端N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)残基的寡糖在参与作为细胞粘附、肿瘤的迁移、脑神经的发育以及病毒成功侵入机体中起重要作用,现今已成为糖生命科学中研究的重点领域之一。而获得足够的唾液酸化寡糖成为探索其功能的基础与关键。目前,虽然化学合成唾液酸化寡糖的方法已经基本确定,但其由于需要繁琐的基团保护和去除步骤,立体选择性差,并且合成的寡糖价格昂贵。而酶法合成唾液酸化寡糖虽然具有高度立体选择性和区域选择性,但是需要昂贵的三磷酸胞苷(CTP)和唾液酸化寡糖前体(CMP-Neu5Ac)作为底物。新近发展起来的全细胞合成技术,虽然可以实现寡糖在细胞内合成,但是由于合成的唾液酸化寡糖全部积累在细胞内,造成产量极低。因此,如何建立CTP和CMP-Neu5Ac的廉价合成以及唾液酸化寡糖的胞外催化合成技术与方法是实现唾液酸化寡糖工业化生产的关键。首先,筛选高效催化胞苷酸CMP合成CTP的酵母,并优化游离酵母全细胞催化体系,实现由廉价CMP到CTP的高效合成。通过筛选不同种类酵母得到催化CMP合成CTP能力最强的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S189,并在此基础上进行涵盖CMP浓度、葡萄糖浓度、pH及温度四个因素的摇瓶优化。确定优化的反应体系为:CMP浓度为40 mmol·L~(-1),葡萄糖浓度为120 mmol·L~(-1),pH为8,温度为37°C,终转化率达到84%,相对优化之前提高了53%。其次,建立优化CMP-Neu5Ac合成酶高效表达与CMP-Neu5Ac催化合成的反应体系。将CMP-Neu5Ac合成酶(NeuA酶)的编码基因neuA分别连接到载体pET28a和pFLAG得到重组质粒pET28a-neuA和p FLAG-neuA,分别转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达,通过分析CMP-Neu5Ac的合成量来评估不同载体系统所表达NeuA酶的比活力并优化催化反应体系。最终确定转化重组质粒pFLAG-neuA的E.coli BL21(DE3)在初始IPTG诱导浓度0.5 mmol·L~(-1),30°C条件下培养15 h酶活最高;E.coli BL21(DE3)-pFLAG-neuA所表达的NeuA酶比活力是13.5 U·mg~(-1),E.coli BL21(DE3)-pET28a-neuA为7.5 U·mg~(-1);通过对CMP-Neu5Ac合成进行优化,得到CMP-Neu5Ac合成最适温度和最适pH分别为38°C和9,最适反应时间为3 h,终产量为2.6 mmol·L~(-1),与优化前相比提高了23%。最后,建立唾液酸化寡糖双酵母耦合催化体系。将α-2,3-唾液酸化寡糖转移酶的编码基因ST23连接表面展示载体pYD1得到重组质粒pYD1-ST23,通过不含色氨酸的SD培养基和菌落PCR筛选得到转化成功的重组菌株EBY100-pYD1-ST23,以YNB-CAA-Glc为发酵培养基,25°C条件下进行诱导表达,将得到的菌液与S.cerevisiae S189酵母泥及重组菌株E.coli BL21(DE3)-pFLAG-neuA的粗酶液按比例1:1:1(v:m:v)混匀,在此基础上将混合菌液与反应液(CMP 10 mmol·L~(-1),Neu5Ac 10 mmol·L~(-1),Lactose 10mmol·L~(-1))按体积比1:1充分混匀,30°C条件下反应2 h后通过薄层色谱法(TLC)成功检测到α-2,3-唾液酸化寡糖的生成。
【图文】：

分子结构图,分子结构,磷脂类

图 1-1 CTP 的分子结构Fig. 1-1 The molecular structure of CTP内的一种正常组分，通过参与核酸、磷脂类及蛋直接穿过血－脑脊液屏障，，它是核酸代谢与磷脂类。还可以增强神经细胞及血管壁细胞膜性结构的合

合成反应,机理,多糖

图1-2 CTP合成反应机理Fig. 1-2 The mechanism of CTP synthesis表面多糖面有许多种多糖，这种多糖在它们与周围环境的相互作用起
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ926;O629.1

【参考文献】