重组新蛭素生产工艺优化及样品稳定性研究

发布时间：2020-06-02 03:41

【摘要】：利用HPLC技术建立定量测定酵母发酵上清液中重组新蛭素(以下简称EH)的方法,该方法的建立为EH生产工艺的改进提供了技术手段,通过该方法实现发酵过程中EH表达量的实时监测,进而对EH发酵条件进行优化,改进发酵工艺及发酵上清超滤条件,提高EH的表达量,降低时间成本和生产成本,提高生产效率。对新工艺生产的EH进行质量检测,符合质量标准。并对EH蛋白影响因素及长期稳定性进行研究。主要内容如下:建立HPLC法定量测定酵母发酵上清液中EH含量的方法,EH在214 nm处有较强的特异性吸收峰,其吸收峰面积与含量存在很好的线性关系,r~2=0.9995,EH线性浓度范围在0.012~4.8 mg/mL。该测定方法具有很好的精密度,样品多次重复测定的RSD值为1.4227%;加标回收率在95%~98%。该方法准确度高、重复性好,进行测定时,可根据EH的特异吸收峰,对发酵过程中发酵上清液中EH含量进行实时定量测定。测定结果显示,在一定时间范围内,EH的表达量与诱导时间成正相关。对重组新蛭素发酵条件进行优化,优化后甲醇诱导时的pH为5.85,甲醇流加起始速率为每升初始发酵液体积3.6mL/h,4h左右后,流加速率增加一倍到每升初始发酵液体积7.3 mL/h。继续流加2h后,适当增大甲醇流速至溶氧保持在4-8%。发酵实验结果表明,在诱导过程中,在一定甲醇流加量范围内,目的蛋白表达量与甲醇流加量成正相关。在发酵后期用HPLC法定时检测发酵上清EH的含量,一旦有下降趋势或不再有明显上升趋势,立即下罐。超滤采用国产的中空纤维柱,下罐后离心上清先经过50kD中空纤维过滤,去除酵母菌碎片和大分子杂质,透过液再经3kD中空纤维进行样品浓缩,与超滤膜包相比极大缩短了超滤时间,降低生产成本,提高生产效率,为二期临床药品的生产制备奠定了基础。对新工艺生产的EH进行质量检测,其蛋白含量、DNA残留、电泳分子量、电泳纯度、免疫印迹蛋白鉴定、HPLC纯度、抗凝活性及内毒素检测等均符合质量标准。对EH蛋白影响因素及长期稳定性进行研究,对光照、高温、高湿及不同pH的影响因素对EH蛋白稳定性试验,以及对原液和成品进行18个月长期稳定性试验。结果显示,EH原液对温度、光照较敏感,在试验及保存过程中应尽量低温避光;EH成品稳定性较好,对光照、高湿不敏感,但在高温条件下会降解。原液可以在-80℃、-20℃中保存18个月;成品可以在-20℃、4℃中保存18个月。
【图文】：

HPLC图谱,图谱,峰面积,灵敏度

图 2-1 不同紫外检测波长（A：214 nm；B：225 nm；C：238 nm；D：280 nm）分析 EH 的HPLC 图谱Figure 2-1 HPLC chromatograms of EH at different wavelengths (A: 214 nm; B: 225 nm; C:238 nm; D: 280 nm)2.3.2 线性关系及灵敏度考察EH（蛋白浓度 2.4 mg/mL，进样量为 4 μL）HPLC 图谱（图 2-2），，得到 12组 EH 的 HPLC 图谱，并对其峰面积进行积分，以 EH 蛋白浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制工作曲线，得到回归方程 Y = 5 × 106X + 62767（r2=0.9995），结果 EH 溶液在浓度 0.012 ~ 4.8 mg/mL 范围内呈现良好的线性关系（图 2-3），蛋白浓度在 0.012 mg/mL 以下和 4.8 mg/mL 以上不在线性范围内；灵敏度考察，本实验中 EH 的最低检测限为 0.012 mg/mL、最高检测限为 4.8mg/mL。

HPLC图谱,发酵液,诱导时间,峰面积

时间（min）图 2-4 发酵液上清的 HPLC 图谱e 2-4 HPLC chromatogram of fermentation supernata峰面积30 × 10525 × 10520 × 10515 × 10510 × 1055 × 105020 40 60 80 100 120诱导时间/h5 发酵上清中的 EH 峰面积与不同诱导时间的关系onship between peak area of EH in fermentation superninduction time
【学位授予单位】：北京工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O657.72;TQ464

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