基于c-MYC G-四链体结构发现高选择性探针及其动力学机识别制研究

发布时间：2020-06-11 05:41

【摘要】：绿色荧光蛋白及其衍生物的发现与应用彻底改变了蛋白质的成像研究。同时,RNA可通过与其结合的核酸适配子及相应的荧光探针来标记,进而分析其在空间和时间上的分布。核磁和晶体结构研究发现G-四链体是某些适配子与荧光探针识别的核心结构。G-四链体是由富含鸟嘌呤(G)的DNA或RNA序列形成的四链体结构,可以形成G-四链体的序列广泛分布于真核细胞端粒末端和启动子区域。采用荧光探针分子识别特定的G-四链体结构,可研究G-四链体形成和解散对基因转录翻译等过程的影响。但目前,缺乏选择性识别特定G-四链体结构的荧光探针,这给G-四链体功能研究以及精确定位细胞中特定的DNA或RNA带来很大的挑战。本工作基于c-MYC Pu22 G-四链体结构中独特的口袋,采用基于结构筛选和基于先导化合物结构的优化策略发现了荧光探针9CI(6-(2-(anthracen-9-ylmethyl ene)hydrazinyl)-N~2,N~4-diphenyl-1,3,5-triazine-2,4-diamine)。该化合物在体外和活细胞中均能高选择性地识别c-MYC Pu22 G-四链体。通过9CI同系物结构-荧光活性关系以及分子动力学模拟发现:9CI和c-MYC Pu22 G-四链体的识别包括初始接触、动态相互作用和稳定堆积等三个过程。这三个过程在9CI的选择性识别c-MYC Pu22 G-四链体方面起了很重要的作用。具体研究结果如下:1、c-MYC Pu22 G-四链体探针的发现、优化及荧光选择性研究1)基于c-MYC Pu22 G-四链体结构中3'端特殊的结构,采用基于结构的虚拟筛选,发现选择性识别c-MYC Pu22 G-四链体的荧光小分子;2)通过生物等排取代,发现了高选择性荧光化合物9CI;3)在体外分子水平,测试了9CI对c-MYC Pu22 G-四链体的选择性;4)在活细胞中,测试9CI对c-MYC Pu22 G-四链体的的选择性。2、9CI与c-MYC Pu22 G-四链体识别的机制研究1)Job plot实验表明9CI与c-MYC Pu22 G-四链体的结合比率为1:1;2)ITC与荧光滴定实验表明9CI与c-MYC Pu22 G-四链体呈现弱亲和性;3)综合运用一维核磁共振氢谱研究以及9CI对c-MYC Pu22G-四链体突变序列的荧光反应发现9CI作用于c-MYC Pu22 G-四链体3'末端口袋中;4)分子对接和分子动力学研究发现9CI和c-MYC Pu22 G-四链体的整个识别过程包括初始接触、动态相互作用和稳定堆积等三个过程。这三个过程在9CI的高荧光识别选择性方面起了很重要的作用。该研究将有助于我们理解荧光小分子识别G-四链体的机制,并指导设计选择性识别G-四链体的配体小分子。
【图文】：

图 1-1 G-平面以及 G-四链体形成的示意图Fig. 1-1 Schematic representation of G-tetrad and examples of possible quadruplexG-四链体种类很多，影响 G-四链体结构多样性的因素包括 G-平面的层数链的走向以及连接环的长度（Bugaut and Balasubramanian 2008）。G-四链两层、三层乃至多层 G-平面通过 π-π 堆积而成。根据 G-四链体结构的数聚体、二聚体和四聚体；按构象可以把 G-四链体分为平行结构、反平行结型结构。如图 1-2 所示，平行结构 G-四链体中 DNA 链的走向为同一个方平行结构中存在两股走向分别相同和相反的 DNA 链（可分为篮式结构和）；混合型 G-四链体中的一股 DNA 与其他三股 DNA 链走向都不同（Reshe 2010, Métifiot et al 2014, Dolinnaya et al 2016）。

G G G T G G G GAG G G T G G G GAAG G G T G G G TAG G G T G G G G1-4 c-MYC NHE Ⅲ1 启动子序列及突变序列er sequence of the c-MYC gene and its mutan报道了喹叨啉与 c-MYC Pu22 G-四链体体侧翼碱基的重要性。喹叨啉诱导 c-M更适合喹叨啉结合的新口袋（Dai et au22 G-四链体结构为平行构象，T20-A2，此 loop 环与其下面 3'端的 G-平面形了与配体小分子结合的口袋，这为设计针提供结构空间（Ou et al 2007, Gonzál
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O657.3

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本文编号：2707455